质谱在蛋白质相互作用研究中的应用----光交联

大范围的光交联
工作流程
细胞培养至一定密度后换为条件培养基
light 350-365nm
Cell lysis SDS-PAGE 质谱鉴定
大范围的光交联
MALDI-TOF-MS
Nature Methods - 2, 261 - 268 (2005) Published online: 23 March 2005
指定蛋白的光交联
pBpa
Nature Methods. 2005 Mar;2(3):201-6. Epub 2005 Feb 17.
指定蛋白的光交联
工作流程
目的基因点突变，构建真核质粒：GFP, HA, His, Flag tag
三转（triple transfection）:含目的基因的质粒，含aaRS的质粒，含tRNA的质粒 难点！！
• 定义： 将某几种修饰过的带有光合基团的氨基酸非特异性的引入蛋白中，从 而实现大范围的光交联。
• 如何引入？
大范围的光交联
• 合成具有光活性的氨基酸
– 含有光活性基团：双吖丙啶环，在365nm光照下，生成中性活泼中间体碳烯，与附 近的C-H键反应。
light
Nature Methods - 2, 261 - 268 (2005) Published online: 23 March 2005
light 350-365nm
收获相互作用蛋白：IP, pull down...
SDS-PAGE
FASP
MALDI-TOF-MS
LC-MS/MS
指定蛋白的光交联
MALDI-TOF-MS
Nature Methods. 2005 Mar;2(3):201-6. Epub 2005 Feb 17.
大范围光交联 (broad range photo-cross-linking )
• 分类
• 指定蛋白的光交联 （specific protein photo-cross-linking）
• 大范围光交联 (broad range photo-cross-linking )
光交联简介
指定蛋白的光交联 ( specific protein photo-cross-linking)
也可用作指定蛋白的光交联：利用含有目的基因的质粒。
总结
• 指定蛋白的光交联
– 优点：获取弱的相互作用蛋白信息，并能够真实的反应体内相互作用情况。 – 局限性：只能在一个蛋白中引入且只能引入一个非天然氨基酸，常需做大批量突
变。
• 大范围的光交联
– 优点：能够获取大范围的相互作用蛋白信息，尤其是用于寻找膜蛋白的相互作用 蛋白,也可用作指定蛋白的光交联。
– 局限性：引入的光活性氨基酸种类有限，可能会丢失一些重要的相互作用信息。
有些蛋白不能很好的表达
遗传学技术
酵母双杂交 合成致死筛选
假阳性 In vitro
蛋白选择有局限性
蛋白质相互作用简介
能够最大限度的反映体内蛋白相互作用的真实情况的方法？
光交联简介
光交联技术
• 基本原理 将带有光交联基团的非天然氨基酸引入蛋白，在波长为350—365nm 的光照射下，和附近蛋白的C-H键形成稳定的共价键。
. Cell. 2009 April 17; 137(2): 216–233. doi:10.1016/j.cell.2009.03.045 . Pharmacol Ther. 2008 April ; 118(1): 58–81
这些通路的紊乱会导致疾病的产生，如
阿尔茨海默症，帕金森综合症，影响胚 胎发育....
• 定义： 通过将目的蛋白特定位置的氨基酸替换为非天然氨基酸进行光 交联，从而获取相互作用信息。
• 如何替换？
指定蛋白的光交联
蛋白质的合成
AMP AMP
Biblioteka Baidu
tRNA
＋
Amino Acid 氨酰tRNA合成酶
tRNA
Amino Acid
Moleculer biology of the gene, the fifth edition
蛋白质相互作用简介
蛋白质相互作用方式
• 稳定的相互作用与瞬时的相互作用形成蛋白质相互作用的内涵。
稳定相互作用形成 蛋白质复合体
（protein complex）
激酶与蛋白的瞬时 相互作用
（enzyme-substrate）
蛋白质相互作用简介
常用的蛋白质相互作用研究技术
GST-pull down
酵母双杂交
噬菌体展示
Co-IP
荧光共振能量转移（FRET）
蛋白质相互作用简介
常用的蛋白质相互作用研究技术
生物物理学方法
GST-pull-down
融合蛋白可能无功能 假阳性
分子生物学方法
免疫共沉淀 荧光共振能量转移技术
假阳性；丢失蛋白相互作用信息 不能反应体内真实作用情况
距离限制 融合蛋白可能无功能
噬菌体展示技术
– 常用的非天然氨基酸: p-benzoyl-L-phenylalanine (pBpa), 加入细胞培养基。 – 对应的tRNA及aaRS： Suppressor tRNATyr （质粒B）， pBpa特异性的大肠杆菌
TyrRS突变体（质粒C）。 – 将质粒A、B、C转入细胞
• 光照发生交联
– 350-365nm
pL: photo-Leu pM: photo-Met pI: photo-Ile pLM: photo-Leu＋ photo-Met pLMI: photo-Leu＋ photo-Met ＋ photo-Ile
大范围的光交联
HA-tagged human PGRMC1
Nature Methods - 2, 261 - 268 (2005) Published online: 23 March 2005
指定蛋白的光交联
• 选取目的蛋白可能的作用位点区域
– 生物信息学手段 – 文献调研
• 作用位点区域的某个氨基酸对应的密码子突变为终止密码子TAG
– 构建含有点突变目的基因的质粒A
• 引入特异的tRNA (suppresor tRNA), 特异的氨酰tRNA合成酶（aaRS） 及非天然氨基酸（cross-linker）。
质谱在蛋白质相互作用研究中的应用 ----光交联
大纲
• 蛋白质相互作用简介 • 光交联简介 • 总结
蛋白质相互作用简介
• 蛋白质与蛋白质之间的相互作用构成了生物反应网络的重要部分。
Notch Pathway
Wnt Pathway
TLR2/4 Pathway
Cell 140,805-820, march 19, 2010.
• 将光活性氨基酸加入不含对应天然氨基酸的条件培养基
大范围的光交联
• 为什么只有三种光活性氨基酸？
– 合成产率的限制 – 这三种氨基酸的结构中有疏水性的脂肪链，可以逃过氨酰tRNA合成酶严格的识别
机制。
紫色：Trna 灰色：氨酰tRNA合成酶 红黄绿色：氨基酸
Moleculer biology of the gene, the fifth edition