第7章 基因文库的构建
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真核生物mRNA分子的3`端有多聚腺核苷酸组成 的poly(A)尾巴，这种特性为分离纯化mRNA分子 提供了方便。
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA文库构建时载体的选择：
由于绝大多数真核生物的mRNA小于
10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体
一个基因文库应该包含的克隆数目与该生物基因 组的大小和被克隆DNA的长度有关。
基因组越大，所需克隆数就越多。克隆时每一个 载体中允许容纳外源DNA片段越长，则所需克隆数越 少。
克隆片段 2×106（细菌） 的平均 大小（bp） 理论数 实际数
5×103 10× 103 20× 103 40× 103 400 200 100 50 1831 919 458 278 基因组的大小（bp） 2×107 （真菌） 3×109 （动物） 理论数 实际数 理论数 实际数 4000 2000 1000 500 18 418 9 208 4 603 2 300 600 000 27 631 109 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 354 386
一、基因组文库的构建
外源基因组的获得及DNA大片段的制备 用于构建基因文库载体的制备 载体与外源DNA片段的连接 体外包装及基因组DNA文库的扩增
真 载核 体基 上因 构组 建 基 因在 组 文噬 库菌 体
DNA λ
基因组DNA的切割
用于基因组文库构建的DNA片段的切割一 般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶 切两种方法，其目的是：
定DNA片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的
几率以克隆到目的基因，一个完整的基因组文库就必须含 有3-10倍于最低重组克隆数的克隆。
二、cDNA文库的构建
RNA提取 分离纯化mRNA cDNA第一链的合成 双链cDNA的合成 cDNA与载体的连接 噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化等
文库中cDNA的克隆数=
细胞总mRNA数
细胞中某种mRNA的拷贝数
例如 某细胞的总mRNA数为500500个
如 获 得 丰 度 为 每 细 胞 3500 拷 贝 (14 拷 贝 ) 的 mRNA 基 因 , 应 构 建 的 文 库 的 最 小 值 为 500500/3500 (14) =143 (35750) ;
通常选质粒载体或噬菌体载体。
以 质 粒 为 载 体 构 建 文 库 示 意 图 cDNA
以 λ 噬 菌 体 作 载 体 构 建 cDNA 文 库 流 程 图
cDNA文库的大小
在某一特定发育阶段和特定组织中,并 非所有的基因都表达,通常表达的基因 仅占基因总数的15%,产生出约15000种 不同的mRNA分子,因此在mRNA水平上分 离目的基因,可以大大地缩小搜寻目的 基因的范围,降低分离目的基因的难度.
●保证DNA片段之间存在部分重叠区 ●保证DNA片段大小均一
超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需 加装人工接头。 酶切法一般选用4对碱基识别序列的限制性 内切酶，如：Sau 3A I或Mbo I等，这样 DNA酶解片段的大小可控。 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载 体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干 的DNA片段随机连为一体！
cDNA 只能反映基因表达的转录及加工后的 mRNA 产物所携带的信息 , 也即 cDNA 序列只与 基因的编码序列有关 , 不能反映基因的内含 子 , 也不能反映基因的转录启动子和终止子 等,所以cDNA便于克隆及大量扩增,构建的文 库复杂性低 , 适于特异基因的分离 , 而且从 cDNA文库分离的目的基因可直接用于表达.
RNA的提取
沉淀细胞； 裂解细胞； 离心除去细胞残渣，上清液用氯仿/酚除去
5s
28s 18s
蛋源自文库；
用95%冷乙醇沉淀RNA。
mRNA的分离
tRNA 总RNA rRNA
PolyATract mRNA Isolation Systerms
10-15%
磁珠吸附法
80-85%
mRNA 1-5%
分子种类繁多， 分子量大小不一
用适当的方法将某一种生物细胞的整 个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将 这些片段与适当的载体进行体外重组；再 引入到适当的宿主细胞中繁殖和扩增，从 而形成含有重组DNA分子的群体。 从理论上讲，这些重组子包含有整个 基因组DNA序列，即包含了该种生物的全部 基因，故称之为基因组文库。
利用纯化的总 mRNA 在逆转录酶作用下 合成互补的 DNA 即 cDNA ，再按上述构建 基因文库的类似方法对 cDNA 片段进行 克隆，由此获得的克隆群体，称之为 cDNA文库。
载体的选择
出于减少重组克隆的数量，用于基因组文 库构建的载体通常选装载量较大的λ-噬菌 体DNA或柯斯质粒；对于大型基因组（如 动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。
上述几种载体的最大装载量如下：
λ-噬菌体DNA
柯斯质粒
25 kb 45 kb
BAC
YAC
300 kb
400 kb
基因组文库的大小
基因库（gene pool）：特定生物体全基因组 的集合（天然存在）
基因文库（gene library or gene bank）：
通过克隆方法保存在适当宿主(一般指细菌)中的某种生物、 组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。
根据构建对象的不同，基因文库分为：
●基因组文库 ●cDNA文库
即约有150 (36000) 个克隆子组成的cDNA文 库中应包含1个如此高(低)丰度的mRNA基因;
基因文库
目的克隆的筛选与 目的基因的分离
文库中总的克隆数较少，则从中筛选
特异基因比较容易，但由于插入片段较 长，以后的分析比较困难。
因为基因组DNA片段是随机克隆的，所以基因组大小除以
克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角
度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率 只有50%。当克隆数增加到这一理论值的2倍时，克隆到特
cDNA第一链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA第二链的合成
cDNA文库构建时载体的选择：
由于绝大多数真核生物的mRNA小于
10 kb，因此用于cDNA文库构建的载体
一个基因文库应该包含的克隆数目与该生物基因 组的大小和被克隆DNA的长度有关。
基因组越大，所需克隆数就越多。克隆时每一个 载体中允许容纳外源DNA片段越长，则所需克隆数越 少。
克隆片段 2×106（细菌） 的平均 大小（bp） 理论数 实际数
5×103 10× 103 20× 103 40× 103 400 200 100 50 1831 919 458 278 基因组的大小（bp） 2×107 （真菌） 3×109 （动物） 理论数 实际数 理论数 实际数 4000 2000 1000 500 18 418 9 208 4 603 2 300 600 000 27 631 109 300 000 1 381 550 150 000 690 774 75 000 354 386
一、基因组文库的构建
外源基因组的获得及DNA大片段的制备 用于构建基因文库载体的制备 载体与外源DNA片段的连接 体外包装及基因组DNA文库的扩增
真 载核 体基 上因 构组 建 基 因在 组 文噬 库菌 体
DNA λ
基因组DNA的切割
用于基因组文库构建的DNA片段的切割一 般采用超声波处理和限制性内切酶部分酶 切两种方法，其目的是：
定DNA片段的几率就上升到75%。所以为了达到一种合理的
几率以克隆到目的基因，一个完整的基因组文库就必须含 有3-10倍于最低重组克隆数的克隆。
二、cDNA文库的构建
RNA提取 分离纯化mRNA cDNA第一链的合成 双链cDNA的合成 cDNA与载体的连接 噬菌体颗粒的包装及转染或质粒的转化等
文库中cDNA的克隆数=
细胞总mRNA数
细胞中某种mRNA的拷贝数
例如 某细胞的总mRNA数为500500个
如 获 得 丰 度 为 每 细 胞 3500 拷 贝 (14 拷 贝 ) 的 mRNA 基 因 , 应 构 建 的 文 库 的 最 小 值 为 500500/3500 (14) =143 (35750) ;
通常选质粒载体或噬菌体载体。
以 质 粒 为 载 体 构 建 文 库 示 意 图 cDNA
以 λ 噬 菌 体 作 载 体 构 建 cDNA 文 库 流 程 图
cDNA文库的大小
在某一特定发育阶段和特定组织中,并 非所有的基因都表达,通常表达的基因 仅占基因总数的15%,产生出约15000种 不同的mRNA分子,因此在mRNA水平上分 离目的基因,可以大大地缩小搜寻目的 基因的范围,降低分离目的基因的难度.
●保证DNA片段之间存在部分重叠区 ●保证DNA片段大小均一
超声波处理后的DNA片段呈平头末端，需 加装人工接头。 酶切法一般选用4对碱基识别序列的限制性 内切酶，如：Sau 3A I或Mbo I等，这样 DNA酶解片段的大小可控。 连接前，上述处理的DNA片段必须根据载 体的装载量进行分级分离，以杜绝不相干 的DNA片段随机连为一体！
cDNA 只能反映基因表达的转录及加工后的 mRNA 产物所携带的信息 , 也即 cDNA 序列只与 基因的编码序列有关 , 不能反映基因的内含 子 , 也不能反映基因的转录启动子和终止子 等,所以cDNA便于克隆及大量扩增,构建的文 库复杂性低 , 适于特异基因的分离 , 而且从 cDNA文库分离的目的基因可直接用于表达.
RNA的提取
沉淀细胞； 裂解细胞； 离心除去细胞残渣，上清液用氯仿/酚除去
5s
28s 18s
蛋源自文库；
用95%冷乙醇沉淀RNA。
mRNA的分离
tRNA 总RNA rRNA
PolyATract mRNA Isolation Systerms
10-15%
磁珠吸附法
80-85%
mRNA 1-5%
分子种类繁多， 分子量大小不一
用适当的方法将某一种生物细胞的整 个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将 这些片段与适当的载体进行体外重组；再 引入到适当的宿主细胞中繁殖和扩增，从 而形成含有重组DNA分子的群体。 从理论上讲，这些重组子包含有整个 基因组DNA序列，即包含了该种生物的全部 基因，故称之为基因组文库。
利用纯化的总 mRNA 在逆转录酶作用下 合成互补的 DNA 即 cDNA ，再按上述构建 基因文库的类似方法对 cDNA 片段进行 克隆，由此获得的克隆群体，称之为 cDNA文库。
载体的选择
出于减少重组克隆的数量，用于基因组文 库构建的载体通常选装载量较大的λ-噬菌 体DNA或柯斯质粒；对于大型基因组（如 动植物和人类）需使用YAC或BAC载体。
上述几种载体的最大装载量如下：
λ-噬菌体DNA
柯斯质粒
25 kb 45 kb
BAC
YAC
300 kb
400 kb
基因组文库的大小
基因库（gene pool）：特定生物体全基因组 的集合（天然存在）
基因文库（gene library or gene bank）：
通过克隆方法保存在适当宿主(一般指细菌)中的某种生物、 组织、器官或细胞类型的所有DNA片段而构成的克隆集合体。
根据构建对象的不同，基因文库分为：
●基因组文库 ●cDNA文库
即约有150 (36000) 个克隆子组成的cDNA文 库中应包含1个如此高(低)丰度的mRNA基因;
基因文库
目的克隆的筛选与 目的基因的分离
文库中总的克隆数较少，则从中筛选
特异基因比较容易，但由于插入片段较 长，以后的分析比较困难。
因为基因组DNA片段是随机克隆的，所以基因组大小除以
克隆片段大小得到的只是克隆数的理论值，从统计学的角
度分析，从这个理论克隆数中克隆到特定基因片段的几率 只有50%。当克隆数增加到这一理论值的2倍时，克隆到特