蛋白酶的筛选

蛋白酶的筛选
1、取土壤，晾干，过40目筛，用无菌水梯度稀释至0.000001g土/1mL水
或0.0000001g土/1mL水，待用
2、配酪素培养基（加琼脂），高压灭菌，倒平板；配LB培养基或发酵培
养基，灭菌，分作液体培养基，另外取一些倒斜面。

3、取1的融入土壤的水1mL涂平板，置于恒温箱，于50度或以上培养
1～3天，挑选有水解圈（透明圈）的菌落用来划斜面（LB），于50度或以上进行纯化培养。

4、取纯化菌株，于液体LB中扩大培养。

5、离心，取沉淀，盐析，透析，得酶液。

6、以酪蛋白为底物，测酶液酶活，若酶活较大，则该菌株为你要的菌株
了。

初筛1：用选择性培养基，把PH调低，则耐酸的才能活，另外，把N源去掉，加入酪素（酪蛋白），其他营养成分照基础培养基就行了，这样，产蛋白酶的菌种能将酪素分解成酪氨酸，就有可利用的N源，不产蛋白酶的菌种不能利用酪素，则没有N源，最后耐酸又产蛋白酶的菌种成为优势菌，挑出，换培养基。

初筛2：初筛1所得菌种用透明圈法（蛋白酶水解酪素产生透明圈，直径越大，酶活越高，具体步骤自己找）挑出蛋白酶活力高的菌种，接入摇瓶培养
复筛：初筛2所得菌以福林试剂法测酶活（以Folin染色，测吸光度，具体步骤自己找），酶活最高者为最终菌种。

一、
酪素培养基
成分：
酪蛋白10g
牛肉膏3g
磷酸氢二钠2g
氯化钠5g
琼脂15g
蒸馏水1000mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液12.5mL
pH7.4
制法：将除指示剂外的各成分混合，加热溶解(但酪蛋白不溶解)，校正pH。

加入指示剂，分装烧瓶，121℃高压灭菌15min。

临用时加热溶化琼脂，冷至50℃，倾注平板。

注：将菌株划线接种于平板上，如沿菌落周围有透明圈形成，即为能水解酪蛋白。

二、
干酪素培养基(用于蛋白酶菌株筛选) 分别配制A液和B液。

A液：称取Na2HPO4·7H2O 1.07g。

干酪素4g，加适量蒸馏水，并加热溶解。

B液：称取KH2PO4 0.36g，加水溶解。

A、B液混合后，加入酪素水解液0.3 mL, 加琼脂20g，最后用蒸馏水定容至1000mL。

酪素水解液的配制：1g酪蛋白溶于碱性缓冲液中，加入1%的枯草芽孢杆菌蛋白酶25mL加水至100mL, 30℃水解lh。

用于配制培养基时，其用量为1000mL培养基中加入100mL以上水解液。

三、酪蛋白培养基
KH2PO40．36g
Na2HPO4·12H2O 1．3g
NaCl 0．1g
ZnSO4·7H2O 0．02g
CaCl2·2H2O 0．002g
酪素4g
酪素水解氨基酸0．05g
琼脂15—20g
蒸馏水1000ml
pH 7．0—7．2
先称取4g酪素，再加入0．5mol/LNaOH约2ml，将酪素溶解；然后依次加入其他药品，最后调pH7．0—7．2。

0．56kg/cm2(8磅/英寸2)，112．6℃灭菌30分钟。