第三节动物的克隆
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（糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量元素、动物血清等。）
3、温度和PH 保证细胞顺利的 36.5 ± 0.5℃，7.2-7.4 生长增殖 4、气体环境： 有O2和CO2（95%空气和5%CO2 ）
[讨论]动物细胞离体培养时，是否会表 现和体内细胞一样的生命活动？
①细胞能生存并保持生长、分裂乃至接触抑制和 有规律的衰老、死亡等。 ②细胞之间相互依存，在某种程度上呈现一定的 组织特性。
4、动物胚胎分割移植
解决某些妊 娠时间长、每胎 产子数量少的优 良种畜的繁殖速 度问题。
练习：
二、动物的细胞融合技术及其应用
1、细胞融合与细胞杂交：
物理法：离心、振荡、电融合技术
诱导方式
化学法：聚乙二醇
生物法：灭活的仙台病毒
灭活的病毒颗粒 黏附于细胞表面
细胞膜被病毒颗粒 穿通，细胞膜连接
细胞融合，形 成杂种细胞
如：哺乳动物的红细胞只 有少量的线粒体。
3、细胞核移植实验和动物的克隆繁殖： 胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞。
绵羊“多莉”克隆过程：
多莉羊的培 育过程：
Ａ母绵羊 卵细胞
Ｂ母绵羊 乳腺细胞
细胞质 细胞核移植
细胞核
融合后的卵细胞 卵裂
早期胚胎 C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊 胚胎移植
克隆羊成功的分子细胞生物学机理： 重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋 白，经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便 全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核 DNA被重新编排，细胞开始表达自己的基因。
•（3）用于检测有毒物质。 •（4）用于生理、病理、药理等方面的研究， 为治疗和预防疾病提供理论依据。
植物细胞和动物细胞培养的比较
比较项目 理论基础 培养基性质 培养基特有成分 植物组织培养 细胞的全能性 固体培养基 蔗糖、 植物激素 植物体 快速繁殖、培育 无病毒植株等 动物细胞培养 细胞增殖 液体培养基 葡萄糖、 动物血清 细胞株、细胞系 获得细胞或 细胞分泌蛋白
传代培养
转入特 殊培养 液中培 养
分瓶培养
细胞系（可传代的细胞）
有限细胞系：二倍体细胞 发生转化的细胞 连续细胞系： 系（遗传物质发 生了改变，具不 死性）
从原代培养物或细胞系中获 得用单细胞分离培养或通过 筛选的方法，由单细胞增殖 形成的细胞群，称细胞株。 遗传物质未变
• 1943年，科学家在致癌物的诱导下培养小 鼠的结缔组织，获得了L-细胞系
2.杂交瘤技术和单克隆抗体制备： (1).传统抗体生产方法：
抗原
刺激
动物体内
效应B
抗体 (抗体不纯)
筛选单一效应B细胞
不能增殖，产生大量抗体
特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏。
(2).单克隆抗体制备过程：
设计方案：
一个B淋 巴细胞
+
小鼠骨髓 瘤细胞
杂交瘤 细胞 特性：
化学性质单一、特异 性强的抗体。
杂交瘤技术制备单抗的最大优点是？ 单抗的作用？
思考题
动物细胞培养过程
悬浮培养
思考题
动物细胞生长特性： （1）贴壁生长：培养瓶中的悬浮液细胞， 紧贴培养瓶内壁才能生长 （2）接触抑制：当培养瓶中内壁生长细 胞彼此紧密接触时，细胞不再分裂 （3）细胞只分裂不分化
如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？ 原代培养 机体中取 下经过处 理后的单 细胞 细胞株：
第二章 克隆技术
第3节 动物的克隆
[阅读任务]阅读P27-31，思考以下问题
1、动物克隆的技术基础是？主要技术基础是？ 2、动物细胞生物学研究为什么普遍采用体外人工培养 方法进行实验？ 3、广义的动物组织培养包括？ 4、动物细胞培养的过程？ 5、动物组织培养与动物细胞培养两者的关系？ 6、原代培养和传代培养的关系,必须传代的原因? 7、细胞系，细胞株的概念及分类 8、细胞克隆的定义和最基本要求，纯系的意义 9、什么细胞容易克隆？ 10、提高细胞克隆形成率的措施？细胞克隆的主要作 用？
克隆培养法：
把一个单细胞从群体中分离出来单独培养， 使之繁衍成一个新的细胞群体(纯系)的技术。 提高细胞克隆形成率的措施： 适宜的培养基、动物血清、滋养细胞、 激素刺激、调节pH等。 应用： 研究遗传规律和生理特性的重要材料。
思考题
6、动物细胞培养技术的应用
•（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰 素、单克隆抗体等。 •（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。
培养结果 培养目的
（二） 动物组织培养技术的发展
1.1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。 “组织培养”一词产生 2.1903年，将皮肤及白细胞培养于腹水及血清中， 细胞存活达一个月，且观察到细胞分裂 3.1907年，将蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，成功看到 真正的组织培养开始；创立了悬浮培养法 神经末端的阿米巴运动。 成功进行了传代培养；发明了卡氏瓶； 4.1912年，对鸡胚心脏组织块进行培养。 研制了人工培养液 大量细胞系的建成标志着组织 5.1943年，获得长期培养细胞系。 培养工作进入了全新阶段
如果不传代，到一定时期培养的细胞就会 因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭， 不能正常生长。
动物细胞培养过程
胚胎或者幼龄动物的组织器官（细胞来源）
剪碎、胰蛋白酶
分离细胞
单个细胞 洗涤、稀释、分离 原代培养
配置成悬浮液
原代细胞（1-10代） 传代培养（极少数）
特点:贴壁生长 接触抑制
细胞株 （遗传物质没有发生改 变、1０-40～50） 细胞系 （遗传物质发生改变）
动物的细胞培养
培养物： 离体的单个的细胞
(胚胎或者幼龄动物的组织器官) 培养环境：人工控制的培养条件
细胞保持生长、分裂 培养过程： 乃至接触抑制和有规 律的衰老、死亡
单个的细胞
培养产物：单一类型的细胞
思考题
（2）动物细胞的培养条件
1、无菌、无毒的环境 （对培养液和用具无菌处理、添加一定量的抗生 素、定期更换培养液） 2、营养
• 1951年，海拉细胞系（肿瘤细胞系）
Βιβλιοθήκη Baidu
• 细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从 原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性 质的细胞。细胞株是具有特殊性质的细胞 系。 • 一般具有恒定染色体组型、同功酶类型、 病毒敏感性和生化特性等。 • 有限细胞株, 连续细胞株:
思考题
从原代培养向传代培养的原因：
体细胞克隆成功的意义： 1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受 精卵时期的功能。 2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。 应用： 为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了 重要途径；对濒危动物的保存也有重要意义。
细胞工程常用的技术手段小结：
植物的克隆：植物组织培养 植物体细胞杂交 动物的克隆：1.动物细胞培养 2.动物细胞融合 3.单克隆抗体 4.核移植 5.胚胎移植 6.胚胎分割移植
动物的组织培养
培养物： 离体的动物组织 培养环境： 人工控制的培养条件 培养过程： 细胞的运动、变化，使得培养物的
组织成分也发生结构和功能变异
培养产物：
单一类型的细胞
组织培养长期培养后最终成为了简单的细胞培 养,因此两者可以统称为组织培养. 器官培养： 器官的原基、器官的一部分或整个器 官，使之在体外和人工控制的条件下得以生存、生 长和保持器官的结构、功能及分化能力。
三、动物的克隆繁殖
1、动物细胞全能性的表现程度： 低等动物 细胞的全能性 一般比较容易 体现。 癌细胞仍 能逆转为正常 细胞。
无论是分化还是癌变，变化的都是表现型， 基因组成的完整性并没有改变。
2、动物难以克隆的根本原因： 基因表达的调控使得 细胞中合成了专一的蛋白 质。 一类基因是维持生存 的；另一类基因随着组织 器官和发育阶段不同而选 择性表达。
一、动物细胞的培养和克隆形成
1、广义的动物组织培养(组培)包括： 细胞培养、组织培养和器官培养。 2、动物组织培养技术的发展： 1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。
1903年，皮肤及白细胞培养于腹水及血清中， 存活1个月。
1907年，美，蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中， 观察到细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。
3、温度和PH 保证细胞顺利的 36.5 ± 0.5℃，7.2-7.4 生长增殖 4、气体环境： 有O2和CO2（95%空气和5%CO2 ）
[讨论]动物细胞离体培养时，是否会表 现和体内细胞一样的生命活动？
①细胞能生存并保持生长、分裂乃至接触抑制和 有规律的衰老、死亡等。 ②细胞之间相互依存，在某种程度上呈现一定的 组织特性。
4、动物胚胎分割移植
解决某些妊 娠时间长、每胎 产子数量少的优 良种畜的繁殖速 度问题。
练习：
二、动物的细胞融合技术及其应用
1、细胞融合与细胞杂交：
物理法：离心、振荡、电融合技术
诱导方式
化学法：聚乙二醇
生物法：灭活的仙台病毒
灭活的病毒颗粒 黏附于细胞表面
细胞膜被病毒颗粒 穿通，细胞膜连接
细胞融合，形 成杂种细胞
如：哺乳动物的红细胞只 有少量的线粒体。
3、细胞核移植实验和动物的克隆繁殖： 胚胎细胞核的移植成功率远高于成体细胞。
绵羊“多莉”克隆过程：
多莉羊的培 育过程：
Ａ母绵羊 卵细胞
Ｂ母绵羊 乳腺细胞
细胞质 细胞核移植
细胞核
融合后的卵细胞 卵裂
早期胚胎 C母绵羊子宫 妊娠 分娩 多莉羊 胚胎移植
克隆羊成功的分子细胞生物学机理： 重组移核细胞丢失了源于乳腺细胞的调节蛋 白，经过三次分裂后，原乳腺细胞的调节蛋白便 全部被卵细胞质中的蛋白因子替换了，因此核 DNA被重新编排，细胞开始表达自己的基因。
•（3）用于检测有毒物质。 •（4）用于生理、病理、药理等方面的研究， 为治疗和预防疾病提供理论依据。
植物细胞和动物细胞培养的比较
比较项目 理论基础 培养基性质 培养基特有成分 植物组织培养 细胞的全能性 固体培养基 蔗糖、 植物激素 植物体 快速繁殖、培育 无病毒植株等 动物细胞培养 细胞增殖 液体培养基 葡萄糖、 动物血清 细胞株、细胞系 获得细胞或 细胞分泌蛋白
传代培养
转入特 殊培养 液中培 养
分瓶培养
细胞系（可传代的细胞）
有限细胞系：二倍体细胞 发生转化的细胞 连续细胞系： 系（遗传物质发 生了改变，具不 死性）
从原代培养物或细胞系中获 得用单细胞分离培养或通过 筛选的方法，由单细胞增殖 形成的细胞群，称细胞株。 遗传物质未变
• 1943年，科学家在致癌物的诱导下培养小 鼠的结缔组织，获得了L-细胞系
2.杂交瘤技术和单克隆抗体制备： (1).传统抗体生产方法：
抗原
刺激
动物体内
效应B
抗体 (抗体不纯)
筛选单一效应B细胞
不能增殖，产生大量抗体
特异性差、纯度低；产量低、反应不够灵敏。
(2).单克隆抗体制备过程：
设计方案：
一个B淋 巴细胞
+
小鼠骨髓 瘤细胞
杂交瘤 细胞 特性：
化学性质单一、特异 性强的抗体。
杂交瘤技术制备单抗的最大优点是？ 单抗的作用？
思考题
动物细胞培养过程
悬浮培养
思考题
动物细胞生长特性： （1）贴壁生长：培养瓶中的悬浮液细胞， 紧贴培养瓶内壁才能生长 （2）接触抑制：当培养瓶中内壁生长细 胞彼此紧密接触时，细胞不再分裂 （3）细胞只分裂不分化
如何界定原代培养和传代培养；细胞株和细胞系？ 原代培养 机体中取 下经过处 理后的单 细胞 细胞株：
第二章 克隆技术
第3节 动物的克隆
[阅读任务]阅读P27-31，思考以下问题
1、动物克隆的技术基础是？主要技术基础是？ 2、动物细胞生物学研究为什么普遍采用体外人工培养 方法进行实验？ 3、广义的动物组织培养包括？ 4、动物细胞培养的过程？ 5、动物组织培养与动物细胞培养两者的关系？ 6、原代培养和传代培养的关系,必须传代的原因? 7、细胞系，细胞株的概念及分类 8、细胞克隆的定义和最基本要求，纯系的意义 9、什么细胞容易克隆？ 10、提高细胞克隆形成率的措施？细胞克隆的主要作 用？
克隆培养法：
把一个单细胞从群体中分离出来单独培养， 使之繁衍成一个新的细胞群体(纯系)的技术。 提高细胞克隆形成率的措施： 适宜的培养基、动物血清、滋养细胞、 激素刺激、调节pH等。 应用： 研究遗传规律和生理特性的重要材料。
思考题
6、动物细胞培养技术的应用
•（1）生产蛋白生物制品：病毒疫苗、干扰 素、单克隆抗体等。 •（2）获得大量自身的皮肤细胞，用于植皮。
培养结果 培养目的
（二） 动物组织培养技术的发展
1.1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。 “组织培养”一词产生 2.1903年，将皮肤及白细胞培养于腹水及血清中， 细胞存活达一个月，且观察到细胞分裂 3.1907年，将蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中，成功看到 真正的组织培养开始；创立了悬浮培养法 神经末端的阿米巴运动。 成功进行了传代培养；发明了卡氏瓶； 4.1912年，对鸡胚心脏组织块进行培养。 研制了人工培养液 大量细胞系的建成标志着组织 5.1943年，获得长期培养细胞系。 培养工作进入了全新阶段
如果不传代，到一定时期培养的细胞就会 因细胞密度过大和代谢消耗引起营养枯竭， 不能正常生长。
动物细胞培养过程
胚胎或者幼龄动物的组织器官（细胞来源）
剪碎、胰蛋白酶
分离细胞
单个细胞 洗涤、稀释、分离 原代培养
配置成悬浮液
原代细胞（1-10代） 传代培养（极少数）
特点:贴壁生长 接触抑制
细胞株 （遗传物质没有发生改 变、1０-40～50） 细胞系 （遗传物质发生改变）
动物的细胞培养
培养物： 离体的单个的细胞
(胚胎或者幼龄动物的组织器官) 培养环境：人工控制的培养条件
细胞保持生长、分裂 培养过程： 乃至接触抑制和有规 律的衰老、死亡
单个的细胞
培养产物：单一类型的细胞
思考题
（2）动物细胞的培养条件
1、无菌、无毒的环境 （对培养液和用具无菌处理、添加一定量的抗生 素、定期更换培养液） 2、营养
• 1951年，海拉细胞系（肿瘤细胞系）
Βιβλιοθήκη Baidu
• 细胞株：通过一定的选择或纯化方法，从 原代培养物或细胞系中获得的具有特殊性 质的细胞。细胞株是具有特殊性质的细胞 系。 • 一般具有恒定染色体组型、同功酶类型、 病毒敏感性和生化特性等。 • 有限细胞株, 连续细胞株:
思考题
从原代培养向传代培养的原因：
体细胞克隆成功的意义： 1、证明了高度分化的细胞也可以回复到类似受 精卵时期的功能。 2、证明了细胞质具有调控细胞核发育的作用。 应用： 为遗传疾病的治疗、优良品种的培育等提供了 重要途径；对濒危动物的保存也有重要意义。
细胞工程常用的技术手段小结：
植物的克隆：植物组织培养 植物体细胞杂交 动物的克隆：1.动物细胞培养 2.动物细胞融合 3.单克隆抗体 4.核移植 5.胚胎移植 6.胚胎分割移植
动物的组织培养
培养物： 离体的动物组织 培养环境： 人工控制的培养条件 培养过程： 细胞的运动、变化，使得培养物的
组织成分也发生结构和功能变异
培养产物：
单一类型的细胞
组织培养长期培养后最终成为了简单的细胞培 养,因此两者可以统称为组织培养. 器官培养： 器官的原基、器官的一部分或整个器 官，使之在体外和人工控制的条件下得以生存、生 长和保持器官的结构、功能及分化能力。
三、动物的克隆繁殖
1、动物细胞全能性的表现程度： 低等动物 细胞的全能性 一般比较容易 体现。 癌细胞仍 能逆转为正常 细胞。
无论是分化还是癌变，变化的都是表现型， 基因组成的完整性并没有改变。
2、动物难以克隆的根本原因： 基因表达的调控使得 细胞中合成了专一的蛋白 质。 一类基因是维持生存 的；另一类基因随着组织 器官和发育阶段不同而选 择性表达。
一、动物细胞的培养和克隆形成
1、广义的动物组织培养(组培)包括： 细胞培养、组织培养和器官培养。 2、动物组织培养技术的发展： 1885年，鸡神经板在生理盐水中培养成活。
1903年，皮肤及白细胞培养于腹水及血清中， 存活1个月。
1907年，美，蛙胚神经管培养在蛙淋巴液中， 观察到细胞的阿米巴运动，创立了悬浮培养法。