血红蛋白的提取和分离

2.凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两 端需用砂纸磨平。 ②底塞的制作：
③顶塞的制作：
插入安装了玻璃管的橡皮塞
④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。
பைடு நூலகம்
⑤安装其他附属结构。
2）凝胶色谱柱填料的处理 （1）凝胶的选择： （ 交联葡聚糖凝胶 ）（G-75） “G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度 及分离范围。 75表示凝胶的得水值，即每克凝胶 膨胀时吸水7.5克。 （2）方法： 配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量 的凝胶浸泡于（蒸馏水 ）中充分溶胀后， 配成（ ）。 凝胶悬浮液
㈢电泳：
电泳：带电粒子在电场的作用下发生迁移的过程 1）原理： 在电场的作用下，这些带电分子会向着与其所带 电荷相反的电极移动，不同蛋白质的带电性质、 电量、形状和大小不同，使带电分子产生不同的 迁移速度，从而实现样品中各种分子（蛋白质， ＤＮＡ等）的分离。
思考：蛋白质为什么带有电荷？ 在一定的PH下，蛋白质可解离的基团会带上电荷 2）影响蛋白质分子运动速度的因素
③洗涤平衡 装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在(50cm ) 高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲 液（pH为7.0）充分（ 洗涤平衡 ）12小时。
注意液面不要低于凝胶表面，否则可能有 气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终 生物大分子物质的分离效果。不能发生洗 脱液流干，露出凝胶颗粒的现象，否则重 新填装。
二 实验操作
蛋白质的提取和分离一般分为四步： 样品处理——粗分离——纯化——纯度鉴定
1.样品处理 血浆 水分
血 液 血细胞
固体物质
白细胞 血小板 两个a－肽链 血红 红细胞 蛋白 两个β 一肽链 （最多） （ 90％ ） 共四条肽链
血浆蛋白 无机盐 磷脂 葡萄糖等
每个肽链环绕一个亚铁血红素基团。此基团可携 带O2或CO2 。血红蛋白因含有血红素而呈红色。
（3）凝胶色谱柱的装填方法
①固定：将色谱柱处置固定在支架上
②装填：
将（ 凝胶悬浮液 ）一次性的缓慢 倒入（ 色谱柱）内，装填时轻轻敲动色 谱柱，使凝胶填装均匀。 注意：凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶 颗粒之间的空隙。装填凝胶柱时不能有气 泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质 的洗脱次序，降低分离效果。
⑤收集：待（ 红色的蛋白质）接近色谱柱底 端时，用试管收集流出液，每（ 5ml ） 收集一试管连续收集
注意正确的加样操作： ①不要触及破坏凝胶面 ②贴壁加样 ③使吸管管口沿管壁环绕移动
3.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳
判断（ 纯化 ）的蛋白质是否达到要求， 需要进行蛋白质的鉴定。
蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它 所带净电荷的多少以及分子的大小等因素
③ SDS作用
为了消除净电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加 入SDS ,SDS所带负电荷的量大大超过了蛋白质 分子原有电荷量。因而掩盖了不同种电荷间的电 荷差别，使电泳迁移率完全取决于分子的大小
电泳检测PCR结果
琼脂糖凝胶电泳
2、原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相 对分子质量较小的蛋白质容易进入凝胶内 部的通道，路程较长,移动速度较慢。 分子质量较大的蛋白质无法进入凝胶内部 的通道，只能在凝胶外部移动，路程较短, 移动速度较快,相对分子质量不同的蛋白质 因此得以分离。
大分子通过凝胶颗粒的间隙，路程短，流动快 小分子穿过凝胶颗粒的内部，路程长，流动慢
(3)分离血红蛋白溶液：试管的溶液分为4层:
第1层（最上层）： （无色透明）甲苯层 第2层（中上层）： （ 脂溶性物质 ）的沉淀层， （白 ）色薄层固体
第3层（中下层）： （血红蛋白 ）的水溶液层 （红色透明 ）的液体
第4层（最下层）： 其它杂质（ 暗红色 ）的沉淀层
用滤纸过滤， 除去脂溶性沉 淀层，于分液 漏斗中静置片 刻后，分出下 层的红色透明 液体。
3）样品加入与洗脱
①加样前
打开下端出口，使柱内凝 胶面上的（ 缓冲液 ）缓 慢下降到与（ 凝胶面 ） 平齐，关闭出口
②加透析样品
①调整缓冲液面：与凝胶面平齐
②滴加透析样品：用（吸管）将1ml（透析液 ） 的样品加到色谱柱的（ 顶端 ） ③样品渗入凝胶床：（样品完全进凝胶层）
④洗脱：打开下端，用磷酸缓冲液洗脱
电荷性质 电荷量 分子形
分子大小
2、常见方法 琼脂糖凝胶电泳和聚丙稀酰胺凝胶电泳 聚丙稀酰胺凝胶：是由单体丙烯酰胺和交联剂 N,N-甲基双丙烯酰胺在引发剂和催化剂的作用下 聚合交联成三维网状结构的凝胶
测定蛋白质相对分子质量通常用十二烷基 硫酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝胶电泳
①应用
十二烷基磺酸钠（SDS）—聚丙稀酰胺凝 胶电泳测定蛋白质分子量 ②原理
本课题可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液 来分离血红蛋白。为何不用鸡血？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行 DNA的提取，哺乳动物红细胞无细胞核，结构简 单，血红蛋白含量丰富便于提取血红蛋白。
(1)红细胞的洗涤
①目的：去除（ 杂质蛋白 ） ②方法：
(2)血红蛋白的释放
加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 （溶解细胞膜） ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10 分钟（加速细胞破裂）, 细胞破裂释放出血红蛋白.
混合物 上 柱
洗 脱
大分子流动快 小分子流动慢
收 集 大分子
收 集 小分子
洗脱：从色谱柱上端不断注入缓冲液， 促使蛋白质分子的差速流动。
㈡ 缓冲溶液：
1、作用： 能够抵制外界的酸或碱的对溶液的PH值 的影响，维持PH基本不变。
2、缓冲溶液的配制 通常由1－2种缓冲剂溶解于水中配制而 成。调节缓冲剂的使用比例就可以制得不同 PH范围内使用的缓冲液。 H2CO3 NaH2PO4 / / NaHCO3 Na2HPO4
思考1 分离生物大分子的基本思路是什么？ 选用一定的物理或化学的方法分离具有 不同物理或化学性质的生物大分子。
思考2 蛋白质的分离和提取的原理是什么？
根据蛋白质各种特性的差异，如分子的形状和大 小、所带电荷的性质和多少、溶解度和吸附的性 质和对其他分子的亲和力等等，可以用来分离不 同蛋白质。
一、基础知识： ㈠ 凝胶色谱法（分配色谱法）： 1、概念：根据被分离物质的蛋白质相对 分子质量的大小，利用凝胶的分子筛作用， 来进行分离。
(4)透析
透析目的：除去样品中分子量较小的杂质或用 于更换样品中的缓冲液。 透析袋一般用硝酸纤维素制成，又称玻璃纸。
思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲 液是什么？它的目的是什么？
磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细 胞内的PH环境，保证血红蛋白的正常结 构和功能
人们用鸡的红细胞提取DNA，用人 的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于 进行DNA的提取，人的红细胞无细胞核， 结构简单，血红蛋白含量丰富便于提取血 红蛋白。