高效液相色谱培训ppt课件

固定滞后体积，改善了梯度性能 梯度百分比
梯度曲线
好的梯度 滞后曲线
保留时间
普通的低压梯度系统 梯度百分比
不好的梯度 滞后曲线
保留时间
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液相色谱的色谱柱
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色谱柱的连接
Stop_depth长度不合适造成柱前死体积
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色谱柱的连接
锥箍锥度不合适造成渗漏
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可能提高柱效的方法
除去柱上端固定相变色部分 (约3mm左右)，再补充新的固 定相。 色谱柱吸附未被洗脱成分时，柱效将明显下降，选合适 的溶剂进行洗净。 采用梯度洗脱时，柱在重复使用前，用泵把几倍于柱体 积的起始溶剂压经柱子，以重新建立起始的平衡来得到再 生。
+ 测量通过溶液后的紫外或可见光光强度的损失 + 吸光度与样品浓度呈线性关系 + 在被测物的最大吸收波长处检测时灵敏度最大
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+ 这种检测器简单、可靠 + 多数人熟悉并喜欢这种技术 + 可以作梯度实验并且是非破坏性的 + 大多数有机化合物有一定程度的吸光度 + 一般来说灵敏度还可以
AU
Parabens at 254 nm
• 理想的HPLC用水应为18.2Ω的超纯水，并通过0.22um 的滤膜，除去热源、有机物、无机离子及空气等。
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过滤与脱气
过滤：0.45um或更小孔径滤膜 目的：除去溶剂中的微小颗粒，避免堵塞色谱柱，尤其是使
用无机盐配制的缓冲液。 脱气：除去流动相中溶解或因混合而产生的气泡 气泡对测定的影响：
选用适宜的容器
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（1）改善分离, 加快分析速度； （2）改善峰形, 减少拖尾, 有利于痕 量组分的检测； （3）增加峰容量； （4）强烈滞留的组分不容易残留在 柱上, 保持柱性能长期良好； （5）下次分析时, 流动相需要一段平 衡时间；不同溶剂的UV吸收程度稍有 差异, 可能会引起基线漂移
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① A 流动相/弱溶剂组成；
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+ 基本原理和特点 + 液相色谱仪器部件 + 实验操作与应用 + 日常维护
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➢ 基本原理：溶于流动相(mobile phase)中的各组分经过固 定相时,由于与 固定相(stationary phase)发生作用(吸附,分 配,离子吸引,排阻,亲和)的大小,强 弱不同,在固定相中滞留 时间不同,从而先后从固定相中流出.
1）泵中气泡使液流波动，改变保留时间和峰面积 2）柱中气泡使流动相绕流，峰变形 3）检测器中的气泡产生基线波动
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流动相的保存
有机溶剂流动相：
室温下密封，避光保存
缓冲盐流动相：
当日现配现用： 低温下密封保存，一般不超过3天 防止微生物生长
有机溶剂与水（缓冲盐）混配的流动相：
低温密封保存 防止有机相的挥发
➢ 特点：分离效率高、分析速度快、应用范围广、操作自动 化。
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流动相 脱气装置
四元泵
检测器 柱温箱 样品盘
控温箱
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启动液相色谱仪器的流程
开启HPLC系统各个设备的电源 打开泵、自动进样器、检测器电源，
待设备通过自检后，打开计算机启动 色谱管理软件 准备流动相
过滤，脱气 色谱泵排气
用新配制的流动相灌注泵
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+ 灵敏度是信号与噪音的比值；即峰高与基线噪音的比值
（S/N） + 检测限（LOD）：S/N = 2~4
6:1
+ 定量限（LOQ）：S/N = 8~10
+ 好的信噪比有利于：
– 更好的色谱峰确认
S
– 更好的定量
– 更好地完成色谱峰纯度/均一性
N
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+ 目前实验室中最流行的选择 – 多数公司约75%的检测器是吸光度检测器（其中50%是 多波长，25%是PDA）
强溶剂 A%
② B 流动相/强溶剂组成；
③ 梯度时间；
④ 梯度曲线：线性、凸型或凹型等。
time
5 2 1
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3 2 1
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+ 低压梯度 – 用单泵产生梯度，泵前（低压端）混合 – 对脱气要求高 – 不易调节梯度的滞后体积
+ 如设计不当，梯度的 准确性受影响 – 滞后体积（系统 体积）设计合理
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低 压
B AC
梯D
度 比例阀
溶剂输送 系统(泵)
阻尼器 混合器
进样器
色谱柱
检测器
滞后(系统)体积
注意∶滞后体积包括进样器、阻尼 器、混合器及其管路 滞后(系统)体积
高 压
溶剂输送 系统(泵)
梯 度
溶剂输送 系统(泵)
进样器
梯度混合器
死体积/谱带展宽体积 (无色谱柱时)
色谱柱
检测器
-ຫໍສະໝຸດ Baidu
滞后体积太大会引起梯度变化的延迟 – 例如：滞后体积为2.0ml，流速1.0ml/min 实际梯度会比设置值晚 2 分钟响应，没有问题 – 对微柱色谱影响更大，同上例但流速0.1ml/min 实际梯度会比设置值晚20 分钟响应，不能接受
pH变化值 0.1
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RS变化值 1.6
按流动相组成分：单组分和多组分 按极性分：极性、弱极性、非极性 按使用方式分：等度洗脱和梯度洗脱
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+ 水：
去离子水 自动纯水仪
纯净水
商品瓶装水
+ 溶剂: 色谱纯（甲醇，乙腈，乙醇，丙酮，异丙醇）
+ 试剂: 分析纯
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• 不管采用何种途径，配制流动相应用新鲜水，水质要 求越高放置时间越短。
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+ 对样品有响应并有一个输出信号 + 应该提供在检测器响应值与样品浓度之间的线性关系；并
且所设计的校正技术应该促进这种关系
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+ 高灵敏度；可忽略的基线噪音 + 宽的线性范围 + 独立于流动相及操作参数的响应
– 对压力、温度及流速等变化不敏感 + 长时间操作的稳定性 + 低死体积 + 非破坏性 + 选择性
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– 输液系统 – 进样系统 – 分离系统 – 检测系统 – 数据记录处理系统
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液相色谱流程图
HPLC色谱柱
数据处理系统
溶剂
自动进样器
色谱泵
检测器
废液
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色谱柱：Zorbax StableBond C18 4.6*250mm,5um
流动相：27%甲醇：73%磷酸 pH： 2.5&2.6 温度： 50℃ 流速： 1.0mL/min.
0.15
0.10
0.05
0.00
0.50
1.00
1.50
2.00
2.50
3.00
3.50
4.00
滞后体积的不同会使方法转换麻烦 – 滞后体积比文献大或小都会使方法不能重现 – 滞后体积的变化会导致梯度重现性不好
普通分析型液相色谱的滞后体积为2~4ml
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设计不好的HPLC系统，滞后体积随反压变化 滞后体积随反压变化的后果：
梯度的准确性不好，造成：方法的适应性不好 用静态梯度混合器；固定滞后体积可明显改善梯度特性