乳铁蛋白综述

摘要

乳铁蛋白是转铁蛋白家族的一员，一种可以结合铁的糖蛋白，分子量在80kDa左右，是近期研究较热门的蛋白之一。乳铁蛋白分子由一条肽链进行了折叠后形成两个对称的叶（N叶和C叶），两叶上都有铁结合位点。缺铁的乳铁蛋白和铁饱和的乳铁蛋白之间的构型有变化，可以相互转换。乳中的乳铁蛋白在脱脂和去酪蛋白后，可以用色谱、超滤、盐析等方法分离纯化，电泳法、HPLC、ELISA 等方法可以用来检测乳铁蛋白的含量。

关键词：乳铁蛋白铁结合折叠纯化检测

Abstract

Lactoferrin is an80kDa iron-binding glycoprotein of the transferrin protein family.It is a simple polypeptide chain folded into two symmetrical lobes(N and C lobes)。Each lobe can bind a iron atom.The conformations of LF vary depending on whether it is binding Fe3+.LF from the milk can be separated and purified by chromatography,ultrafiltration or salting after degreasing and remove the casein.The concentration of LF can be measured by electrophoresis,HPLC,ELISA and so on.

Key Words:lactoferrin iron-binding fold purification measurement

乳铁蛋白（Lactoferrin ，LF ）是近期研究比较热门的蛋白，具有转运铁的功能，能够促进人体铁的蛋白。

一．乳铁蛋白的来源

乳铁蛋白于20世纪30年代，在牛奶中被发现，被称为红蛋白。乳铁蛋白是铁传递蛋白（transferrin ）家族中的一员，是具有结合铁功能的糖蛋白。转铁蛋白还包括血清转铁蛋白（serum transferrin ）、卵转铁蛋白（ovotransferrin ）、黑素转铁蛋白（melanotransferrin ）和碳酸酐酶抑制剂（the inhibitor of carbonic anhydrase ）[1]。

这种糖蛋白还在粘膜分泌物中发现，如眼泪、唾液、阴道分泌物、精液、鼻和支气管分泌物、胆汁、胃和肠分泌物、尿液，其中常乳和初乳中的含量最高[2]。牛奶中的乳铁蛋白是由腺上皮细胞合成的。人乳和牛乳中乳铁蛋白含量随着哺乳期的延长而减少，但牛乳在非哺乳期LF 保持较高的含量[3]。奶酪乳清中的乳铁蛋白浓度大约是100mg/L 。

表1人乳和牛乳中LF 的含量[3]

二．理化性质

乳铁蛋白的分子量800kDa 左右，内含（铁结合部位），铁半饱和到饱和的乳铁蛋白成红色，在475nm 处有特殊的吸收峰。

（一）铁结合

乳铁蛋白结合Fe 3+是可逆的，根据结合Fe 3+的多寡，可将乳铁蛋白分为缺铁型乳铁蛋白（apo-LF ）、铁半饱和型和铁饱和型（holo-LF ）。抗巴氏杀菌变性能力依次为：holo-LF>铁半饱和型>apo-LF 。天然状态的乳铁蛋白是部分饱和的。乳铁蛋白结合Fe 3+的能力依赖于CO 32-或者HCO 3-，而与柠檬酸盐的浓度呈负关系[4]。

（二）等电点

乳铁蛋白是碱性蛋白，表面具有多个带正电碱性区域。牛乳中的乳铁蛋白的等电点为pH8.0±0.2，人乳铁蛋白的pI 是5.6-6.1[4]。

（三）热稳定性

乳铁蛋白在碱性条件和中性条件下，容易失活。牛乳铁蛋白在pH 6.6的条件下，65～69℃时就发生失活。酸性条件下脱铁L F （apo-LF ）非常稳定，pH 4.0、90℃处理5min ，其铁结合能力、抗原活性以及抗菌活性与未处理前相同；在65～95初乳

常乳人乳

6~14mg/ml 1.0~3.2mg/ml 牛乳1~5mg/ml 0.02~0.35mg/ml

℃的范围内，LF的热变性程度随温度升高而逐渐增加。另外人们发现，LF的热稳定性随铁饱和度的增加而增加，而且含铁LF的两叶（lobes）也具有不同的热稳定性。这可能是由于含铁LF的结构更紧密因而更难以失活。此外，脱铁LF在pH2.0～3.0，100～200℃处理5min时明显发生降解，而其抗菌活性却有所增强。这表明降解以后的小分子仍具有抗菌活性，LF的活性部位是很稳定的，能耐受酸性降解[5]。

牛乳铁蛋白的热稳定性取决于环境因素，如pH、盐和乳清蛋白。牛奶中的apo-bLF和holo-bLF比在磷酸缓冲液中对热更敏感。而在磷酸缓冲液中，apo-bLF 比holo-bLF变性得更快[6]。

图1：乳铁蛋白的分子结构

三．分子结构

（一）氨基酸序列

现在确定的乳铁蛋白氨基酸序列，包括了从人、鼠、牛、马、猪、山羊、绵羊、水牛和骆驼中得出的数据。一个乳铁蛋白分子含有大约690个氨基酸残基[7]，这9个生物体的乳铁蛋白具有高度的同源性，其中有两个显著的共同特征：（1）内部序列的两倍重叠；（2）高pH的碱性特征[8]。

（二）分子结构

乳铁蛋白分子立体结构主要呈“二枚银杏叶型”，由一条简易的多肽链折叠成两个对称的叶（N叶和C叶）形成，两叶都成环状结构，由一条部分α螺旋的铰链连接。人LF中，α螺旋区（铰链）由第333-343氨基酸残基组成，N叶是第1-332的氨基酸残基，C端是344-703氨基酸残基[9]。

LF多肽链由α螺旋和β折叠构成，N叶和C叶都折叠成相似的结构，大约有40%的相似性，不同之处在于环状叶结构。每叶都有2个相似的α/β结构域（N 叶：N1和N2；C叶：C1和C2），其中一叶基于6束β层状结构，另一叶基于5束β层状结构。每个结构域能够协同一个CO

2-，结合一个金属离子。结合的金

3

属离子主要是Fe2+和Fe3+，但发现Cu2+、Zn2+和Mn2+也可以结合[2]。结构域中的铁结合位点是一个深深的裂缝。目前X衍射的最大分辨率（2.8A）尚不能分辨此2个铁位点的不同[10]。

乳铁蛋白的一级结构中的半胱氨酸（Cys）的数量和位置决定着分子内二硫键的形成，而N端和C端的天门酰胺则是几个潜在的N-糖基化位点。分子中非共价的链接，大多数是疏水的，给两叶提供了一个缓冲部位，而C末端的螺旋（第678-691氨基酸残基，hLF）可以相互的作用。螺旋的N末端对着域间的裂缝，使得裂缝处带正电荷，另一个螺旋，N2（或C2）是CO

2-的结合部位[11]。

3

图2乳铁蛋白的多肽链折叠[7]

a.铁饱和乳铁蛋白（holo-LF）。N叶在左边，C叶在右边（即多肽链的C末端和N末端）。标识着N1、N2、C1、C2的结构域（N1、C1黄色，N2、C2绿色）。连接两叶的螺旋结构H和C端螺旋显示为蓝色。两个铁结合部位为红色。

b.脱铁乳铁蛋白（apo-LF），两个晶体结构之一。N叶（左边）是开放的，在铁结合位点后有一个54°旋转的铰链。，而C叶是关闭的，即使在没有铁结合的状态下。另一种脱铁乳铁蛋白的晶体结构被发现，N叶和C叶同时关闭或开放。

这两个个状态之间的转变，正是转运铁的过程。

（三）乳铁蛋白的铁结合

乳铁蛋白结合Fe3+是可逆的，根据Fe3+的存在，可以分为脱铁LF（apo-LF）和铁饱和LF（holo-LF），并且这个不同状态的乳铁蛋白有不同的三维结构。apo-LF有一个开放的构型，而holo-LF有一个关闭的分子结构，并可以避免水解[12]。

1.铁结合和关闭的holo-lF结构[7]

铁结合到乳铁蛋白上后，N叶和C叶的两个结构域都关闭，与铁螯合。四个蛋白配体，再加上结合的CO

2-，共价结合金属离子，每个金属离子都交联N

3