植病研究法---细菌病害的研究法

分装100ml，灭菌后。加过滤灭菌的1% 2，3，5一氯化三苯基四 氮唑(TTC)的水溶液到灭菌冷却到55℃的培养基中，使浓度最后 达到0.005%。青枯菌 P.solanacearum 培养2天后，致病力强的野 生型菌落白色，或中间有一淡红色点的菌落；致病力弱或丧失致 病力的菌落深红色，边缘带蓝色。
知道细菌的数量。细菌计数的方法有： ① 测数器计数法；
② 混浊度计数法；
③ 平板菌落计数法。 • 前两种方法是计数活的和死的细菌的总数，后一种方 法是测定活细菌数目。
（1）测数器计数法
纽鲍尔(Neubauer)血球计数板是常用的一种。它是一块很厚
的载玻片，上面划有每边长为O.05mm的小方格，方格的深度是0.1 mm。
pH7.2。 荧光假单胞菌在培养基中产生可扩散的青或褐色的色素，紫外 线照射显示青到蓝色。此培养基也可用于欧文氏菌属(Erwinia)细菌 的分离。
③Kelmen(1954)TTC培养基：
蛋白胨 10.0g 葡萄糖 5.0g 蒸馏水 1000ml 酪朊水解物 1.0g 琼胶 15.0g pH7.0
第二节
病原细菌的分离培养
• 植物病原细菌一般都是用稀释分离法。病原细菌在组 织中的数量很大，稀释培养可以使病原细菌与杂菌分 开，形成分散的菌落，容易分离得到纯培养。组织分 离法对病原细菌是不适用的，原因是它不能使病原细 菌与杂菌分开，杂菌生长快，会抑制病原细菌的生长。 稀释分离有以下两种方法。
1.培养皿稀释分离法
不适当或存放的时间太长。因此，在灭菌后和使用前，最好是再核
对一下培养基的酸度。
二、分离培养基
（1）通用培养基: NA培养基 （2）属和种的选择性培养基 • [1]土壤杆菌属(Agrobacterium) 一般是用甘露糖醇培养基
甘露糖醇 15g 6g 0.1g 硝酸钠(NaNO3) 5g
硝酸钙[Ca(NO3)z· 4Hz0 320mg
培养基I 2g lg 1g 0.14g 一 一 2g 100ml
培养基Ⅱ 2g 一 1g 一 0.15g 0.15g 2g 100ml
酸度调节到pH7.2。培养基I 适用于观察非荧光性色素，培养 基Ⅱ适用于观察荧光性色素。荧光性色素的产生可以直接观察或 用紫外线照射观察。
四、细菌的计数
• 细菌的繁殖量、植物接种和血清学方面的研究都要求
[3]黄单胞菌属(Xanthomonas)
①蔗糖蛋白胨培养基(Aay wood 1960)
蔗糖 2.0% 蛋白胨0.5% 琼胶 磷酸氢二钾(K2HPO4) 1.5% 蒸馏水 0.05% 硫酸镁(MgSO4· 20) 0.025% 7H
100wk.baidu.comml
pH 7.2～7.4
这是分离Xanthomonas属细菌最常用的培养基，也适用于假单胞菌属、欧文 氏菌属和有些棒杆菌属的细菌， ②SX琼胶培养基(Schaad and White，1974)
• 划线分离法的关键是要等到琼胶平板表面的冷凝水完全消失后才
能划线，否则细菌将在冷凝水中流动而影响形成单个分散的菌落。 为了加快消除冷凝水，可以将培养皿在37℃的温箱中放一二天， 或者在无菌的条件下，将培养皿的盖打开，翻转培养皿斜靠在盖 上，在50℃的干燥箱中干燥30min。
植物病原细菌的分离还需注意：
随后将聚果胶酸钠加入，高速搅拌15s，分装三角瓶灭菌后要 立即倒入培养皿，制成平板干燥后使用。欧文氏菌属细菌有分解 果胶酶活性的，形成中间有凹陷的菌落。
[5]棒形杆菌属(Clavibacter)
此属细菌有些是难培养的。酵母葡萄糖矿物盐琼胶培养基(YGM) 是很好的一种。 酵母浸膏 2.0g 葡萄糖 2.．5g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 0.25g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.25g 硫酸镁(MgSO4· 2O) 0.1g 7H 硫酸锰(MnSO4) 0.15g 氯化钠(NaCl) 0.05g 硫酸铁(FeSO4· 2O) 0.005g 7H 琼胶 15.0g 蒸馏水 1000ml 适用于分离棒杆菌．也适用于Xanthomonas。
前面介绍的培养基有许多也适用于欧文氏菌属，以下是对欧文氏 菌具有特色的结晶紫聚果胶培养基。将搅碎器预加热，加500ml 煮沸的蒸馏水，将以下成分依次加入，低速搅拌:
结晶紫的10%水溶液 1.0ml 4.5ml
lmol/L氢氧化钠(NaOH) 4.5ml
氯化钙(CaCl2· 2O)新鲜配制的1% 水溶液 2H 琼胶 2g 硝酸钠(NaNO3) 1.0g
水溶性色素: 扩散到培养基中就能使培养基变色，其中有些色
素是荧光性的。假单胞菌属细菌能否产生荧光性色素，是很重要
的分类特征。 色素的产生与培养基有关，如在新鲜牛肉配成的培养
基上，荧光性色素的产生要比用牛肉浸膏配成的更为明显。为了
测定假单胞菌属细菌色素的产生，可用特殊的如金氏培养基,有两 种配方：
蛋白胨 硫酸钾(K2SO4) 甘油 氯化镁(MgCl2) 磷酸氢二钾(K2HPO4) 硫酸镁(MgSO4· 2O) 7H 琼胶(水洗) 蒸馏水
[2]琼胶斜面培养性状
斜面的培养性状: 生长量的多少、菌苔的形状、颜色光泽和粘度，以及培 养基的颜色和有无特殊的气味等。细菌学上往往将菌苔的形状分为丝状、 念珠状、薄膜状、分枝状和根状等。菌苔的表面有光滑的、不平整的和 有皱褶的。菌苔的颜色也不同，质地有粘质的、膜质的或蜡质的。菌苔 有透明的、半透明或不透明的，表面有暗色的或发亮的。
| pH值6.8 由于培养基中含有十二烷基硫酸钠，已经有一定的选择性。 ②金氏培养基B(King‘s medium B)，分离有荧光的假单胞菌
蛋白胨 20.0g 磷酸氢二钾(K2HPO4) 琼胶 15.0g 1.5g 甘油 10.0g 硫酸镁(MgSO4· 7H2O) 蒸馏水 1000ml 1.5g
肉汁冻培养液常常用来观察培养性状。培养性状主要是指生长量、
表面生长情况、色素的产生、有无沉淀和特殊气味等。
表面的生长情况包括是否形成菌膜和菌环以及它们的厚度、细菌是
否形成团状的漂浮物。
培养液表面下生长的情况包括混浊程度，是均匀的云雾状还是形成
团粒状和片状的菌团。
底部的性状则指有无沉积物和沉积物的形状。
• 细菌悬浮液的配法有时影响分离的效果。一般植物病原细菌，用 灭菌水稀释是适宜的。有时改用灭菌的生理食盐水(0.85%的NaCl) 或肉汁冻培养液稀释比较好。如水稻白叶枯病细菌，用蛋白胨水
或粘土悬浮液稀释的，培养后形成菌落的数目比用清水稀释的多。
粘土的作用大致是细菌团聚在土粒上，更容易形成菌落。
2.平板划线分离法
不能将形成黄色菌落的植物病原细菌都当作黄单胞菌属的细
菌。如玉米蔫萎病细菌，曾经分在黄单胞菌属中，但是根据它的 黄色素与黄单胞菌属的细菌显然不同，现在已经分在泛生菌属(Pa ntoea)。欧文氏菌属的细菌，除去有些可产生非水溶性的蓝色素外， 有的也能产生非水溶性的黄色素，菌落也呈黄色。有些棒杆菌属 细菌也能形成黄色菌落。
测数时，先将盖玻片放在计数计上有刻度的位置，从盖玻片
的一侧加小滴适当稀释的孢子悬浮液，然后在显微镜下观察每小 格中孢子的数目；观察80小格，以它的平均数乘以4000000，就是
每毫升悬浮液中孢子的数目。
• 测定时注意事项：
• （1）取待测稀释菌悬液向血球计数板加样前，须将菌悬液充分摇匀。 • （2）加样过程中，应避免将菌液滴在盖玻片
第三部分 植物细菌病害研究技术
• 第一节 植物病原细菌的鉴定
• 第二节 病原细菌的分离培养
• 第三节 病原细菌培养性状观察
• 第四节 致病性测定
• 第五节 细菌的形态观察
第一节 植物病原细菌的鉴定
• 1．细菌病害标本的检查 • (1)症状的观察 植物细菌病害表现各种类型的症状，不同属的细菌侵染植物后引起的症状 有所不同。 棒形杆菌属细菌主要引起萎蔫， 假单胞菌属细菌主要引起叶斑和叶枯（少数枝枯、蔫萎和软腐）， 黄单胞菌属细菌主要引起叶斑和叶枯，土壤杆菌属细菌主要引起瘤肿（少数 其他畸形）， 欧文氏菌属细菌主要引起软腐（少数蔫萎和枝枯）。这样的区分虽然不是绝 对的，但是指出它们之间的关系，在诊断上是很有意义的。 许多细菌性病害的病斑带有水渍状，有时可以作为诊断的特征，但并不是所 有细菌病害都是这样。 • 病部有时有菌脓排出。菌脓灰白色到黄色，珠状或其他形状，干燥后在表面形 成菌膜。
[3]琼胶平板培养性状
了解平板上菌落的 特征，有助于判断分 离是否正确和挑取所 需的菌落。琼胶平板 上菌落的观察主要是： 形状和大小、颜色和 光泽、表面是否隆起 或凹陷、边缘的形状、 透明度和粘度、培养 基颜色的变化等。
2.细菌的色素
非水溶性色素:不能扩散到培养基中，所以菌落表现不
同的颜色，而培养基则不改变颜色。黄单胞菌属的细 菌能够形成非水溶性的黄色素，所以菌落是黄色的。
可溶性淀粉 10g 蒸馏水1000ml 牛肉浸膏 5g 磷酸二氢钾(KH2PO4) 2g 琼胶 15g
适用于分离可以水解淀粉的X.campestris的致病变种。必要时还可以加1% 甲基紫 B 的20%的酒精溶液 lml，甲基绿的1%水溶液 2ml，和环己酰亚胺 2 50mg，提高它的选择性。
[4]欧文氏菌属(Erwinia)
[2]适宜的培养基
• 分离失败的原因，有时是由于培养基不适宜。一般来说，寄生性
细菌对培养基的要求要比腐生性细菌严格。同时，一种适宜于纯培 养的培养基(细菌群集没有其他杂菌干扰)，不一定适宜于分离(细菌
分散而单独存在，同时还可能有杂菌干扰)。
• 因此，分离时要选用适当的培养基，有时要用选择性培养基。但 有时失败的原因不是培养基的成分不适宜，而是由于培养基的酸度
• 取小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过2次以后，放在灭菌载
玻片上的灭菌水中，用灭菌玻棒研碎。静置一定时间，用灭菌的移 植环蘸取以上组织液在琼胶平板上划线培养; 先在平板的一侧顺序 划3～5条线，再将培养皿转60°将移植环灭菌后,从第二条线末端， 顺序划出3-5条线。目的都是使细菌分开形成分散的菌落。
[1]分离材料新鲜
要从新鲜的标本和新的病斑分离。存放太久的标本，其中病原细
菌的生活力减弱，而腐生性细菌则滋长很快，从这种组织分离到 的大都是腐生菌。
分离用的标本最好是夹在吸水纸中邮寄，放在塑料袋中保湿是不
适宜的。
标本保存的时间较长而不容易直接分离成功，可以经过接种后再
分离.例如，分离软腐病细菌时，由于腐烂组织中往往杂有大量的 腐生菌，可以挑取少许腐烂组织针刺接种在相应的健全组织上， 发病以后再从接种的组织上分离。
氯化锂(LiCl) 溴百里酚蓝 蒸馏水
磷酸氢二钾(K2HPO4)
琼胶 15g
2g
硫酸镁(MgSO4· 7H20) 0.2g
1000ml
灭菌后酸度是pH7.2，培养基呈深蓝色。土壤杆菌属细菌的菌 落圆形、凸起、发亮，最初浅蓝色，以后深绿色。溴百里酚蓝抑制 革兰氏反应阳性的细菌，氯化锂抑制假单胞菌属细菌。以上培养基， 已有选择性培养基的作用，以甘露糖醇作为碳源是它的特点。
• 取灭菌的培养皿3个，每个培养皿中加灭菌水0.5ml，切取约4mm
见方的小块病组织，经过表面消毒和灭菌水洗过3次以后，移在第
一个培养皿的水滴中。用灭菌的玻棒将病组织研碎，静置10～15m in，使组织中的细菌流入水中(配成悬浮液)，然后用灭菌的移植环 从第一个培养皿中移植3环到第二个培养皿中，充分混合后再移植 3环到第三个培养皿中。然后，将溶化的琼胶培养基冷却到45℃左 右，倒在三个培养皿中。冷却凝固后，将培养皿翻转，在适温下 培养。培养皿用记号笔注明分离材料、日期和稀释编号。
[2]假单胞菌属(Pseudomonas)
没有特殊的营养要求，许多培养基都可用于分离。常用的培养基有： ①甘油酪朊水解物培养基
甘油 10ml 酪朊水解物 1g 磷酸氢二钠(Na2HPO4) 2.3g 琼胶 15g 蒸馏水 1000ml 蔗糖 10g 氯化铵(NH4c1) 5g 硫酸十二烷基钠 0.6g
第三节 培养性状
培养性状对细菌的鉴定是很重要的。不同属的植物病原细菌， 它们的培养性状显然不同。不同种的植物病原细菌，很难根据它 们的培养性状区别，但可以作为最后鉴别的参考
1.培养性状的描述
培养性状要分别在培养液、琼胶斜面和琼胶平板上观察。描 述时，要指明培养基、培养时间和培养温度等。
[1]培养液培养性状