蛋白酶产生菌的筛选

蛋白酶产生菌的筛选

组别：第* 组班

级：生工** 班组

员：***

指导老师：***

一、实验目的

学习从自然界中分离蛋白酶产生菌

二、实验内容

蛋白酶产生菌的分离

三、实验原理

许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是最常见的蛋白

酶产生菌。本实验将土壤样品悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及

其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到奶粉培养

平板并进行培养，根据奶粉平板的水解圈做初筛。将初筛的蛋白

酶产生菌接入产酶培养基振荡培养，测定蛋白酶的活力，最终得

到产蛋白酶的芽孢杆菌。也可直接将细菌接种到奶粉培养平板进

行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

四、实验材料和用具

1. 材料：土壤样品

2. 试剂：牛肉膏蛋白胨培养及平板、奶粉培养基平板、45mL

无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液、

3. 仪器及用具：紫外分光光度计、显微镜、恒温水浴锅、摇

床、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液

管、无菌试管、量筒、容量瓶、漏斗、试剂

瓶、漏斗、载玻片、滤纸、擦镜纸。

五、操作步骤

（一）配制所需培养基

按照以下配方配制所需的培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏0.5g ，蛋白胨1g，NaCl 0.5g ，

琼脂 1.5～2.0g ，水100ml ，pH 7.2

配制200mL

奶粉培养基：牛肉膏0.5g ，蛋白胨1g，NaCl 0.5g ，

琼脂 2.0g ，水100ml ，pH 7.0 ～7.2

脱脂奶粉3g ，配制200mL

（二）分离

1. 采集土壤样品，用无菌水植被1:10 土壤悬液。

2. 取1:10 土壤悬液 5 mL，注入已灭过菌的试管中，将此试

管放入75～80℃水浴中热处理10min 以杀死非芽孢细菌。

3. 取加热处理过的土壤悬液100 ～200 μL，涂布接种到牛肉膏

蛋白胨培养平板，后将平板倒置，于30～32℃下培养24～48h.

4. 对长出的单菌落进行编号，选择表面干燥、粗糙、不透明

的菌落，挑取少许菌苔涂片，做芽孢染色，判断是否为芽

孢杆菌。

（三）筛选

1、从判定为芽孢杆菌的菌落处，分别挑取少许菌苔，先接种

奶粉斜面培养基，再转接奶粉培养基平板上，30～32 ℃下培养24 ～48h 。

2、选择水解圈直径与菌落直径比值大的菌，接入牛肉膏蛋白胨培养基30-32 ℃振荡培养48 小时，将发酵液过滤或离心，取清夜检测蛋白酶活力进行复筛。

六、实验结果：

相关图片：

（2））菌株的分离

根据菌落大小、形状、表面光泽、隆起程度、透明程度、边缘性

状和菌落颜色的差别，最终从培养基上筛选出23 个菌落。

（3））将分离到的菌株分别接种到含脱脂奶粉的培养基上，置于

32℃培养60h ，于室温下观察是否产生细胞外蛋白酶，分解培养基

中的脱脂牛奶，进而产生肉眼可见的水解透明圈。结果表明，在

接种的23 株菌落中，共有18 株产生胞外蛋白酶分解脱脂牛奶，

形成肉眼可见的透明圈。从中筛选出9 株水解圈与菌落直径比值

较大的菌株。如下表：

菌株编

号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 比值++ ++ + ++ ++ + + + + 说明：“+”表示：水解圈与菌落直径比值约为3：1，“++”表示：水解

圈与菌落直径大于3：1.。

六、结果分析

在奶粉培养基平板上，蛋白质被孢芽杆菌产生的蛋白酶水解，形成透明圈（见实验相关图片）。不同种类的微生物产生的蛋白酶的种类和活力各不相同，起对奶粉中蛋白质的水解能力各不

相同，所形成的水解圈与菌落大小比值故而不同，因而根据其比

值可初步断定其对奶粉中蛋白质的水解能力。

组员签字：

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