(完整版)荷叶中生物碱提取设计方案
不同产地荷叶总生物碱的含量测定
学号:3506014009毕业设计（论文）题目：不同产地荷叶总生物碱的含量测定院（部）系药学院所学专业药学年级、班级完成人姓名指导教师姓名专业技术职称2010年 6 月 12 日论文原创性保证书我保证所提交的论文都是自己独立完成，如有抄袭、剽窃、雷同等现象，愿承担相应后果，接受学校的处理。
专业：药学班级：2006级药学本科二班签名：年月日目的荷叶中生物碱类化合物的生物活性较高，本实验通过对生物碱类成分几种不同提取方法的对比，确定最优提取方法。
用最优提取方法分别测定22种不同产地的荷叶粉末中生物碱类成分含量，为荷叶药材质量控制提供实验依据。
方法本实验用于荷叶中总生物碱类成分的提取方法主要有以下几种：酸水回流提取法、醇提回流提取法以及氨水-氯仿超声提取法。
其中，酸水提取法的工艺条件为：水提取量为荷叶量的35倍，提取温度为85℃，提取时间为2h，提取液PH为2~3；醇提法工艺条件为：醇提取量为荷叶的30倍分两次回流提取，提取温度为85℃，两次的提取时间共3.5h；氨水-氯仿超声提取法采用0.3g荷叶粉末，25ml氯仿和0.5ml氨水在常温下超声提取30min。
含量测定方法采用紫外可见分光光度法，以荷叶碱为对照，溴甲酚绿为显色剂，在415nm 波长下测定吸光度。
结果氨水-氯仿超声提取法提取最为完全。
用氨水-氯仿超声提取法分别对22种不同产地的荷叶粉末进行提取，用紫外分光光度法测得的吸光度各不相同。
结论不同产地的荷叶中生物碱类成分含量不同。
关键词：荷叶；生物碱类成分；提取方法；紫外分光光度法；含量测定Objective: The alkaloid in nelumbo nucifera is highly activated.Through this experiment ,we used several different ways extracting alkaloid,to determine the best extraction.The best extraction will be used to extract the alkaloid from different places,to determine the different content of alkaloid.Methods: There are three methods used to extract the alkaloid from nelumbo nucifera in this experiment:acid-water extraction ,alcohol extraction and ammonia-chloroform supersonic extraction.The progress of acid-water extraction is:water35 times as much as the mass of powder,85℃for 2h,pH2~3.Alcohol extraction:alcohol 30 times as much as the mass of powder,into two return to extract,85℃altogether for 3.5h.Ammonia-chloroform supersonic extraction:0.3g powder,25ml chloroform,0.5ml ammonia,ultrasound for 30 min at normal temperature.UV is used as the method of content determination,alkaloid for comparison,bromo cresol green for colour developing agent,determin the wavelength at 415 nm.Results: Ammonia-chloroform supersonic extraction is believed to be the best method.In this way ,we test all the nelumbo nucifera powder and get different absorbance.Conclusion: The alkaloid content in nelumbo nucifera from different habitats is of great difference.Key words: nelumbo nucifera ;alkaloid;extract;UV;content determination正文 (1)前言 (1)仪器与试剂 (1)实验方法与结果 (2)讨论 (8)结论 (9)参考文献 (10)文献综述 (11)致谢 (14)附录 (15)不同产地荷叶总生物碱的含量测定学生：李双娟指导教师：王福刚（泰山医学院药学院，泰安271016）1前言荷叶作为我国的传统中药在医学应用中历史悠久，据《本草纲目》记载，“荷叶服之，令人瘦劣”、“生发元气，裨助脾胃”等，而且荷叶在我国南北方均有种植，民间广泛用于食物及药物中。
荷叶中荷叶碱提取工艺的研究_赵骏 (1)
Ref erences:[1] Fu Y H,Han W D,Xu H X.S imultaneou s determination ofstrych nine and bru cine in S emen Strychni by HPLC[J].J Chin Phar m Univ(中国药科大学学报),1998,29(4):281-283.[2] Xu L H,Lu J.Determination of s trychnine and brucine in S e-men S trych ni and preparations by HPLC[J].Chin J P harmA nal(药物分析杂志),1998,18(6):383-385.[3] Zh ang Z Q,Sha M,Yuan C L,et al.Determination of s trych-nin e and b rucin e in S emen S tryc hni and S hangke Qiw ei Tablets by HPLC[J].Chin T rad it H erb Dr ugs(中草药),1998,29(4):236-237.[4] Lu Y X,Cui J,L iu Y.Determin ation of strych nine andbr ucine in Qubidan Capsule by RP-HPLC[J].Ch in H osp P harm J(中国医院药学杂志),2001,21(8):474-475. [5] Li S L,Chen B Y.S imultaneous determination of s trychnineand bru cine in M aqianz i Pow der by RP-HPLC[J].Chin P harm J(中国药学杂志),1998,33(3):168-169.荷叶中荷叶碱提取工艺的研究赵 骏,王洪章,齐喜红,高敏燕,高 钊X(天津中医学院,天津 300193) 荷叶为睡莲科植物莲N elumbo nucif era Gaertn.的干燥叶,具有清热利湿,升发清阳,降脂减肥、止血散瘀等作用。
一种从荷叶中提取荷叶碱的制备方法[发明专利]
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专利名称：一种从荷叶中提取荷叶碱的制备方法专利类型：发明专利
发明人：叶桂银
申请号：CN201811355905.5
申请日：20181115
公开号：CN111187209A
公开日：
20200522
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种从荷叶中提取荷叶碱的制备方法，其特征在于以下步骤：1）取干燥荷叶，研磨制成粗粉；2）取粗粉，lg纤维素酶和40mL pH=5的柠檬酸缓冲溶液；3）于50℃水浴锅恒温酶解2h；4）再加入150mL 0．5％HCl溶液，浸泡16h，超声20min；5）抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后调pH值至3，再以5000r／min离心分离，清液用氯仿萃取2次；6）合并氯仿液，蒸干氯仿，得到荷叶碱，再用无水乙醇溶解。
申请人：南京艾蒙利特生物科技有限公司
地址：210046 江苏省南京市栖霞区尧化街道科创路1号金港科创园3号楼101-B102
国籍：CN
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荷叶碱的提取分离及其应用
Ｙ ｌ ｗ Ｒｖｒ ａｉ ｎ ｈｊ ｎ ｉ ｒ ａｉ． Ｉｈｓｒ ｒａｌ ｆｏ ｎ ｅ ｉｎ ｆｃｃ ，ｂｃｕｅｉｃｎａ ｓｍ ｎ ｅｌ ｉ ｓ ａ ｄＺ ｕｉ ｇＲ ｖ ｓ ｏ ｅＢ ｎ ａ ｅ Ｂ ｎ ｔ ａ ｍａ ｂ ｄａｄｍ ｄ ｉｅｅ ａｙ ｅａｓ ｏｔｉ ａｙ ｅ ｋ ｅｏ ｃ ｉ ｆ ｔ ｎ
及植物固醇等多种功能性成分而具有显著的药食疗功效 。荷 叶中含有 的荷 叶碱 是一种阿朴啡 型生物碱 ，药理
研究表明其为荷叶中主要的降脂成分 。最 近研究者 们多倾 向于对荷 叶生物碱 类化合 物的降脂 减肥 、抗病 毒 、 抑菌 、抗惊厥等作用进行研究 ，但 是很 少有人研 究荷叶碱 。 目前荷 叶碱的需求量不 断增加 ，但是 缺少方便有 效的分离分析荷叶碱的方法 ，限制了对荷叶资源进一步 的开 发和利用 。本文综述 了荷叶总生 物碱的提取 、荷 叶碱的分离纯化 、含量测定和生理活性的研究现状 ，以期为荷 叶碱 的深 入研究 和合理开发利用提供参考 。 关键词 ：荷叶 ；荷叶碱 ；提取 分离 ；色谱法 ；大孔树脂
：
中， 洗脱液经蒸干后得 固体，荷叶碱在相应 的固 体 中质 量分数 为 ６． ％ 。封 聚强 等 ¨ ８５ 用 Ｄ ０ １１大
孔吸 附树脂进 行分 离 纯 化 ，２ ％ ～ ７ ％ 的 乙醇 梯 ０ ０
荷 叶 为 睡 莲 科 植 物 莲 （ ｅ ｍ ｏ ｕｉｒ Ｎ ｌ ｂ ｎｃｅａ ｕ ｆ Ｇ ｅｎ ） 的干燥 叶 ，在 食用 及药 用 等 方面 均 有较 ａｒ ． ｔ 广 泛 的 应 用 。 自古 中 国 人 民 就 视 荷 叶 为 珍 贵 食 品 ，人 们将荷 叶 、荷花 制 茶 作 为 滋 补饮 品 ，传 统 的荷 叶蒸 肉 、荷 叶包 饭 、荷 叶东坡 鱼 、等 ，一直
荷叶总生物碱提取物及其制备方法[发明专利]
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专利名称：荷叶总生物碱提取物及其制备方法专利类型：发明专利
发明人：刘斌,石任兵,王伟,王玉霞,王玲玲,王东方申请号：CN200710122644.8
申请日：20070711
公开号：CN101085041A
公开日：
20071212
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种从中药荷叶中提取得到的总生物碱提取物及其制备方法。
该提取物主要包括荷叶碱、N－去甲基荷叶碱、O－去甲基荷叶碱、番荔枝碱、莲碱、鹅掌揪碱、N－去甲基亚美罂粟碱、2－羟基－1－甲氧基阿朴啡、亚美帕碱、N－甲基异衡州乌药碱、N－甲基衡州乌药碱、去氢荷叶碱、去氢莲碱及其衍生物等。
该提取物可由溶剂提取法、溶剂萃取法、离子交换树脂法、大孔吸附树脂法、超临界流体萃取法、柱色谱法、液－液逆流分配色谱法等任意一种方法，或这些方法的任意组合制备获得。
所制得的荷叶总生物碱提取物中各种生物碱类成分百分含量的总和为5～100％(w/w)，其中荷叶碱含量占全部总生物碱含量的5～100％(w/w)。
申请人：石任兵,刘斌
地址：100102 北京市朝阳区望京中环南路6号
国籍：CN
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紫外分光光度法检测荷叶中荷叶生物碱..
RSD为2.10 %，说明了荷叶生物碱在0.02～0.10mg/mL 范围内线性关系良好，说明了紫外分光光度
法适用于荷叶中荷叶生物碱含量检测和测定。此次实验较薄层扫描法、高效液相色谱法，紫外分光
光度法更为简便适用。
Ending • 衷心感谢各位老师的指导
汇报结束 谢谢大家!
请各位批评指正
• 样品荷叶生物碱经溴甲酚绿染色后的最大吸收波长
样品经溴甲酚绿染色后的最大吸收波长。称取荷叶2.0g，加入浓度为80%的乙醇80mL，于80℃ 的恒温水 浴加热。趁热过滤，用80%乙醇定容至80mL，即为样品液。吸取1mL样品液于10mL分液漏斗中，挥去乙醇， 加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液1mL，溴甲酚绿溶液1mL，振荡，加入5mL氯仿，振荡30s，静置30min。取下层 氯仿液4mL，以未加样品液的乙醇试剂空白为对照，在紫外分光光度计的190～800nm下扫描，测出样品液 经溴甲酚绿染色后的最大吸收波长。
• 3. 3 荷叶碱标准曲线制备
分别精密吸取荷叶碱标准品溶液0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mL于5mL容量瓶中，氯仿定容，以 试验得出的最佳含量测定条件操作，以试剂氯仿空白为参比液，在最大吸收波长处测定吸光度，制 作标准曲线。
• 3. 4 重现性实验
按制备荷叶碱标准曲线的方法，取2mL浓度为0.02mg/mL的标准品溶液5份，在415nm下测定吸光 度值。
样品荷叶生物碱经溴甲酚绿染色后
•
经测量得知溴甲酚绿染色后的样品在415nm处有最大吸收波长，故本实验以415nm为含量测定
最大波长。
4.2 荷叶碱标准曲线制备 • 不同浓度的荷叶碱标准品溶液在415nm处的吸光值标准曲线如图4所示
在最大吸收波长415nm处测定吸光度及其浓度对照图可得标准曲线图方程为y=14.12x0.013,R=0.9998（n=5），表明荷叶碱在0.02～0.10mg/mL 范围内线性关系良好。
荷叶中生物碱的提取及组成成分的分析
归 方 程 为 ： Ｃ（μｇ／ ｍＬ）＝ ５９ ． ０１Ａ－ ９ ． ５６５ ， 相 关 系 数
Ｒ ＝０．９９９９（式中 ｃ 为生物碱浓度， ｍｇ／ｍＬ； Ａ 为吸光度）。
（３）荷 叶 总 生 物 碱 含 量 的 测 定 ： 准 确 称 取 一 定 量
的生物碱粗品（ｗ２， 单位为 ｍｇ）， 按上述方法同样处理 后进行测定， 根据回归方程计算出荷叶总生物碱的
综上所述， 提取生物碱的最优工艺条件为 ｐＨ２．０， 乙 醇浓度为 ９０％， 液固比为 ２５∶１， 提 取 时 间
提取物与应用
荷叶中生物碱的提取及 组成成分的分析
单 斌 １，２， 邓泽元 １＊， 熊冬梅 １， 唐丽君 １， 邓胜国 １ （１．南昌大学食品科学与技术国家重点实验室， 南昌大学高等研究院，
南昌 ３３００４７； ２．韶关学院英东生物科学学院， 韶关 ５１２００５）
摘要： 实验是同步提取荷叶黄酮、生物碱、多糖工艺研究中提取生物碱的工艺部分， 在提取荷叶黄
疗 心 脑 血 管 疾 病 等 功 能［２－ ３］； 荷 叶 中 所 含 生 物 碱 多 为 异 喹 啉 类 生 物 碱 ， 主 要 成 分 为 荷 叶 碱 （Ｎｕｎｃｉｆｅｒｉｎｅ）、 亚 美 罂 粟 碱（Ａｒｍｅｐａｖｉｎｅ）、原 荷 叶 碱（Ｐｒｏｎｕｃｉｆｅｒｉｎｅ）、
收稿日期： ２００８－ ０３－ ２９
（１）溴甲酚绿缓冲液的制备： 精确称取溴甲酚绿 １２５ ｍｇ， 用 ０．２ ｍｏｌ／Ｌ ＮａＯＨ １２．５ ｍＬ 溶解， 加入邻苯 二甲酸氢钾 ２．５５ ｍｇ， 加少量水溶解， 转移至 ２５０ ｍＬ 容量瓶中定容， 备用。
（２）荷 叶 碱 标 准 曲 线 的 制 作 ： 精 确 称 取 荷 叶 碱 ４ ｍｇ， 置于 １００ ｍＬ 容量瓶中， 加无水乙醇定容。分别 取 ４０ μｇ／ｍＬ 荷叶碱溶液 ０．０、５．０、１０．０、１５．０、２０．０、
荷叶中荷叶碱的提取、分离、纯化检测方法
绝大多数生物碱是利用溶剂提取法进行提取，而溶剂提取方法主要包括酸水提取法、醇类溶剂提取法、亲脂性有机溶剂提取法。
当然按具体操作可分为浸渍法、渗漉法、煎煮法、热回流法和连续回流法(索氏提取法)。
浸渍法是将处理过的药材用适当的溶剂在常温或温热的情况下浸渍以溶出其中成分。
该法一般是在常温下进行，对热敏性的物质的提取很有利，但所需时间长，效率低，尤其是水作溶剂时易发霉变质。
渗漉法是往药材粗粉中不断添加溶剂使其渗过粗粉，从渗漉筒下端流出浸提液的方法。
此方法浸出效果优于浸渍法，适用于有效成分含量低或贵重药材的提取。
但是费时较长，所用溶剂量比较大。
操作麻烦。
煎煮法是将中药粗粉加水加热煮沸，将中药成份提取出来的方法。
·此法简便．药中大部分成分可被不同程度的提出，但含挥发性及有效成分遇热易破坏的中药不宜用此法。
热回流法最大的特点在于通过溶剂的蒸发与回流，使得每次与原料接触的溶剂都是纯溶剂，从而大大提高了萃取动力，达到提高萃取速度和效果的目的．但提取效率不高，受热易破坏的成分不宜使用此方法。
连续回流法此法是利用索氏提取器，多次提取生物碱，可以反复利用溶剂，提取效率高，且操作方便。
连续提取法提取液受热时间长，因此对受热易分解的成分也不适用。
新技术酶法应用纤维素酶、果胶酶等作用于植物药材，使细胞壁及细胞质中的纤维素、果胶等物质降解，减小有效成分从细胞内向提取介质扩散的传质阻力，促进有效成分的提取。
这种方法的实质是通过酶解反应强化传质过程。
微波辅助提取法微波辅助提取法是使用合适的溶剂在微波反应器中从天然药用植物、矿物、动物组织中提取各种化学成分的技术和方法。
在提取过程中，一方面微波辐射过程使高频电磁波穿透溶剂到达物料内部。
由于吸收微波能细胞内部温度迅速上升，使其细胞内部压力超过细胞壁的膨胀承受能力，导致细胞破裂，胞内有效成分自由流出，在较低的温度条件下被溶剂捕获并溶解。
另一方面，微波所产生的电磁场加速了被提组分趋向溶剂界面的扩散速率，缩短了有效成分的分子由物料内部扩散到溶剂界面的时间，从而使浸提速率提高数倍，同时还降低了浸提温度，最大限度地保证浸提的质量超声波辅助提取技术根据超声波具有空化、粉碎、搅拌等特殊作用，在超声场中，物料吸收声能温度升高，有效成分的溶解加速。
荷叶黄酮及生物碱的提取研究_陈海光
#工艺技术
荷叶黄酮的提取率随提取温度的升高而提高，温 提取率上升的趋势变缓。 度超过 ."7 以上， !& )& ’ 提取时间的影响 荷叶黄酮的提取率随提取时间延长而提高，但超
#工艺技术
食品科学
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而提高，但 .$8 下的提取率与 /$8 的提取率已相差 不大； 随提取时间的延长， 提取率有所上升， 超过 "( ,: 以后， 提取率随时间上升的趋势已变缓。
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张汉文 ( 银耳菌种生理性变与生态失控所致病害的探讨 ( 食用菌， #$$$- ). )! / )0( 蒋丽， 陈惠音， 夏枫耿， 杨汝德 ( 深层发酵猴头菌的研究 ( 食品科学， #$$+- #. #) / #,(
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食品科学
!工艺技术
次萃取，除去脂质及树脂，水层加 "& ,: (;<= 调 >= 值至 * 左右，过滤，除去鞣质，继续加 "& ,: (;<= 至 >= 值为 / ? ))，用氯仿 )""@% 分三次萃取，合并氯仿 层， 蒸馏回收氯仿， 浓缩物定容至 )"@%。 取提取液 )@%， 加 )& ’& !& ! 最大吸收峰波长的确定： 于分液漏斗中， 摇动， 入 ,@% 氯仿及 )@% 的溴甲酚氯， 静置，分到氯仿层 +@%，加无水乙醇 )@%，在 6;AB@;C 分光光度计上扫描其吸收曲线。再作空白试剂扫描， 比较两扫描曲线，确定荷叶生物碱的最大吸收峰波 长。 )& ’& !& ’ 提取液吸光度的测定 分别取不同条件所得的提取液，经上述同样处理 后，在紫外分光光度计上以最大吸收峰的波长测定其 吸光度。 ! !& ) !& )& ) 结果与讨论
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含量：不同地区荷叶中的荷叶碱含量不一，在0.275%-1.37%左右,一般含量在0.683%。
理化性质：荷叶生物碱碱性较弱，不能直接溶于水，但能与酸作用生成盐溶于水。
荷叶中生物碱类化合物种类繁多，根据母核结构的不同可将其分为三类：(1)阿朴啡类：包括荷叶碱(Nuciferine，N-去甲荷叶碱(N．nomuciferine)，O-去甲荷叶碱(O．nornuciferine)，莲碱(Roemerine)，番荔枝碱(Anonaine)，鹅掌楸碱(Lirioderine)，N-去甲基亚美罂粟碱(N．norarmepavine)。
(2)单苄基异喹啉类：包括亚美罂粟碱(Armepavine)、衡州乌药碱(Coclaurine)、N-甲基异衡州乌药碱(N—Methylisococlaurine)、N一甲基衡州乌药碱(N-methycolaurine)、O一去甲基衡州乌药碱(O-Norcoclaurine)。
(3)去氢阿朴啡类：去氢荷叶碱(Dehydronuciferine)，去氢莲碱(Dehydroroemerine)荷叶中主要的5种生物碱结构提取方法：（1）酸水提取法：a）称取荷叶粉10g，加入200mL pH2.5盐酸溶液，在80℃水浴恒温提取2.5h，过滤，滤渣再用100mL盐酸溶液提取1.5h，过滤，合并两次滤液，用旋转蒸发仪真空浓缩至50mL，过滤，滤液调pH值至2～3，用氯仿60mL分三次萃取，弃去氯仿层，以除去脂类和树脂。
取上层液体，加入2％NaOH调节pH至7左右，静置片刻，待肉眼可见沉淀，过滤，除去鞣质。
滤液再加2％NaOH调节pH至10.5，再用氯仿90 mL分3次萃取，合并氯仿液，在旋转蒸发仪中蒸发干燥后，用少量pH2.5 HCl溶液在超声波清洗机上洗脱生物碱，转移至100毫升容量瓶，定容，摇匀得荷叶总生物碱提取液，备用。
b) 称取荷叶粉末1g放入圆底烧瓶中，加入35ml蒸馏水，用0.5%盐酸调节pH2~3，圆底烧瓶上接40cm冷凝管，85℃冷凝回流提取2h，提取结束后，提取液用滤纸过滤，用30ml氯仿分两次萃取酸水液，弃去氯仿层。
酸水中加入0.5%氢氧化钠调节Ph7左右，静置，滤纸滤过，再加0.5%氢氧化钠调节pH9~11，再用60ml氯仿分2次萃取至水中无生物碱为止，合并氯仿液，在旋转蒸发仪中蒸干后，加入25ml氯仿，超声洗脱即得（2）酶法：称取5 g荷叶粉，加1 g纤维素酶和40 mL pH=5的柠檬酸缓冲溶液，于50 ℃水浴锅恒温酶解2 h，再加入150 mL 0.5% HCl溶液，浸泡16 h，超声20 min，抽滤，滤液经旋转蒸发仪浓缩后调pH值至3，再以5 000 r/min离心分离，清液用氯仿萃取2次，合并氯仿液，蒸干氯仿，得到荷叶碱。
（3）醇提法: 称取荷叶粉末5g，加95%乙醇80ml浸泡30min，85℃回流提取2h，过滤，滤渣用95%乙醇70ml回流提取1.5h，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至20ml，即为荷叶生物碱粗提取液（4）氯仿及氨水超声提取法: 称取荷叶粉末0.3g置于50ml锥形瓶中，精密加入氨水0.5ml，氯仿25ml，常温下超声提取30min，放冷，滤过，滤渣用少量溶剂洗涤两次，合并溶剂，并定容至50ml量瓶中，备用分离纯化：（1）制备高效液相色谱分离纯化（不考虑）（2）大孔吸附树脂分离（D001型阳离子交换树脂）树脂预处理：(1)乙醇浸泡：将树脂浸泡在95％或无水乙醇中，并不时用玻璃棒搅拌，使树脂和乙醇充分的接触，一般为24 h，以便从孔中赶出空气。
(2)乙醇冲洗：将浸泡24 h后的大孔吸附树脂装柱，再用95％或无水乙醇冲洗，直至流出液清亮，加二倍体积重蒸水无浑浊现象，并在200-400rim范围内除了乙醇本身的吸收峰外无其他吸收峰为止。
(3)重蒸水冲洗：用大量重蒸水充分洗涤树脂至无乙醇气味为止。
装柱：(1)将玻璃层析柱垂直固定在实验架上，关闭柱底活塞，在柱中加入一定量的重蒸馏水。
(2)树脂带水边搅拌边缓慢加入层析柱中。
(3)保持层析柱中水面高于树脂层面3 cm以上，过多的水由柱底的活塞放出。
洗脱：将荷叶总生物碱提取液直接加入预先处理好的大孔吸附树脂柱进行洗脱。
吸附条件：上样液pH 10、NaCl浓度1mol／L、吸附流速2．5BV／h洗脱条件：pH 3的50％乙醇、洗脱流速1．5BV／h荷叶碱含量测定（可见分光光度法）（1）对照品溶液的制备：精确称量荷叶碱标准样品4mg，用氯仿溶解后定容于10mL容量瓶中，用移液管移取lmL于另一10mL容量瓶中，再次定容，摇匀，得对照品溶液，备用。
（2）最大吸收波长的确定：取对照品溶液和荷叶总生物碱提取液各lmL，加入氯仿5mL、溴甲酚绿溶液2mL和pH2．O邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液3mL于分液漏斗中，摇匀、静置5分钟，取下层氯仿4 mL于刻度试管，以氯仿加溴甲酚绿溶液和邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液萃取液为空白，在350-520nm波长范围内进行扫描，确定荷叶生物碱的最大吸收波长。
（3）标准曲线的制作：分别准确吸取0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5mL 对照品溶液于6个5mL容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，摇匀，5mL全部移至分液漏斗中，加入溴钾酚绿溶液2mL和pH2．0邻苯二甲酸氢钾溶液3mL，摇匀，静置，取氯仿层4mL于刻度试管中，在最大吸收波长下测定吸光度。
以对照品溶液浓度(pg／mL) 为横坐标，吸光度(OD值)为纵坐标绘制标准曲线，经计算得到回归方程。
（4）测定：取荷叶总生物碱提取液，在可见分光光度计上测定其吸光度，根据回归方程计算总生物碱含量。
计划使用的实验方案：荷叶碱的提取：醇提法: 称取荷叶粉末5g，加90%乙醇80ml浸泡30min，80℃回流提取2h，过滤，滤渣用95%乙醇70ml回流提取1.5h，过滤，合并滤液，用旋转蒸发仪浓缩至20ml，即为荷叶生物碱粗提取液。
荷叶碱的分离纯化：大孔吸附树脂分离（D001型阳离子交换树脂）树脂预处理：(1)乙醇浸泡：将树脂浸泡在95％或无水乙醇中，并不时用玻璃棒搅拌，使树脂和乙醇充分的接触，一般为24 h，以便从孔中赶出空气。
(2)乙醇冲洗：将浸泡24 h后的大孔吸附树脂装柱，再用95％或无水乙醇冲洗，直至流出液清亮，加二倍体积重蒸水无浑浊现象，并在200-400nm范围内除了乙醇本身的吸收峰外无其他吸收峰为止。
(3)重蒸水冲洗：用大量重蒸水充分洗涤树脂至无乙醇气味为止。
装柱：(1)将玻璃层析柱垂直固定在实验架上，关闭柱底活塞，在柱中加入一定量的重蒸馏水。
(2)树脂带水边搅拌边缓慢加入层析柱中。
(3)保持层析柱中水面高于树脂层面3 cm以上，过多的水由柱底的活塞放出。
洗脱：将荷叶总生物碱提取液直接加入预先处理好的大孔吸附树脂柱进行洗脱。
吸附条件：上样液pH 10、NaCl浓度1mol／L、吸附流速2．5BV／h洗脱条件：pH 3的50％乙醇、洗脱流速1．5BV／h荷叶碱的含量测定：（可见分光光度法）（1）对照品溶液的制备：精确称量荷叶碱标准样品4mg，用氯仿溶解后定容于10mL容量瓶中，用移液管移取1lmL于另一10mL容量瓶中，再次定容，摇匀，得对照品溶液，备用。
（2）最大吸收波长的确定：取对照品溶液和荷叶总生物碱提取液各lmL，加入氯仿5mL、溴甲酚绿溶液2mL和pH2．O邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液3mL于分液漏斗中，摇匀、静置5分钟，取下层氯仿4 mL于刻度试管，以氯仿加溴甲酚绿溶液和邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液萃取液为空白，在350-520nm波长范围内进行扫描，确定荷叶生物碱的最大吸收波长。
（3）标准曲线的制作：分别准确吸取0、0．5、1．0、1．5、2．0、2．5mL对照品溶液于6个5mL容量瓶中，加三氯甲烷定容至刻度，摇匀，5mL全部移至分液漏斗中，加入溴钾酚绿溶液2mL和pH2．0邻苯二甲酸氢钾溶液3mL，摇匀，静置，取氯仿层4mL于刻度试管中，在最大吸收波长下测定吸光度。
以对照品溶液浓度(pg／mL) 为横坐标，吸光度(OD值)为纵坐标绘制标准曲线，经计算得到回归方程。
（4）测定：取荷叶总生物碱提取液，在可见分光光度计上测定其吸光度，根据回归方程计算总生物碱含量。
初步检测：取1ml样品于10ml分液漏斗中，加入邻苯二甲酸氢钾缓冲液1ml，溴甲酚绿1ml，振荡，加入5ml氯仿，振荡30s，静置30min。
取下层氯仿4ml，以未加样品液乙醇试剂空白对照，在415nm下扫描，测出样品的吸光度。
溶液的配制：（1）溴甲酚绿溶液，称取溴甲酚绿0.10g，加入7.2ml的0.02mol/LNaOH 溶液溶解，蒸馏水定容至250ml；（2）0.02mol/LNaOH，称取0.08gNaOH于100ml的容量瓶中，加蒸馏水稀释至刻度；（3）邻苯二甲酸氢钾缓冲液，将邻苯二甲酸氢钾粉末倒入250ml容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度;（4）80%乙醇，称取80ml无水乙醇再加20ml水（其他浓度乙醇配制方法相似）；（5）0.42mg/ml荷叶标准品溶液，电子天平称取4.2mg荷叶标准品于10ml容量瓶中，加水至刻度定容。
实验仪器、材料：材料：荷叶仪器：恒温水浴锅、过滤装置、旋转蒸发仪、萃取装置、超声波清洗机、100毫升容量瓶、D001型阳离子交换树脂、玻璃层析柱、2个10mL容量瓶、1ml移液管、刻度试管、分光光度计、6个5mL容量瓶试剂：无水乙醇、1mol／L NaCl溶液、荷叶碱标准样品、溴甲酚绿溶液、邻苯二甲酸氢钾缓冲溶液。