第三章质粒载体剖析
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第三章质粒载体剖析
环形双链DNA质粒分子的三种构型
OC L
SC
第三章质粒载体剖析
不同质粒DNA分子量差异显著，最小的 不足2kb，仅能编码2－3种蛋白质，大 的可达几百kb。
第三章质粒载体剖析
（三）质粒的类型
Hale Waihona Puke Baidu1、根据质粒的性状特征分为：
（1）F质粒：又叫F因子或性质粒。能够使寄主染色体上的 基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。
第三章 质粒载体
第一节 质粒载体概况 第二节 质粒DNA的分离与纯化 第三节 质粒载体的构建 第四节 重要的质粒载体 第五节 质粒载体的稳定性问题
第三章质粒载体剖析
第一节 质粒载体的概况
➢ 1、质粒的定义、命名 ➢ 2、质粒的基本生物学特性
第三章质粒载体剖析
克隆载体：通过不同途径能将承载的外源DNA片段（基因）带入受 体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。
第三章质粒载体剖析
2、碱裂解法
原理：是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间， 在拓扑学上的差异发展出来的。
加热或PH介于12.0-12.5的范围内，线性DNA会被变性，两条链会完 全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补 的两条链仍会紧密结合在一起，不会被变性。
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
第三章质粒载体剖析
分离纯化质粒DNA的程序
第三章质粒载体剖析
3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
离心收集细胞沉淀； 细胞悬浮液重新悬浮细胞； 裂解液使细胞裂解，释放出DNA，同时使DNA变性； 中和液使质粒和染色体DAN复性； 离心除去染色体DNA、蛋白质及RNA等复活物； 含有质粒超螺旋DNA的上清液用酚臭提除去蛋白质； 乙醇沉淀收集质粒DNA。
ColE1质粒 质粒DNA的迁移：由共存的结合型质粒引发的非结合型 质粒的转移过程叫质粒的迁移。 3、显性质粒和隐蔽质粒：如抗性质粒（R质粒）、降解 质粒、Ti质粒。
第三章质粒载体剖析
（四）质粒DAN的复制
质粒的复制受质粒和寄主细胞双重遗传系统的控制。 严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称
作为克隆载体的DNA分子必须具备的条件： 1、有1至多个克隆位点。供外源DNA片段插入克隆载体DNA分子。 2、能自我复制或整合到染色体DNA上随染色体DNA复制而同步复制。 3、有用于选择重组子的标记基因。 4、载体必须安全，不会任意转入除受体细胞外的其他生物的细胞。
第三章质粒载体剖析
一、质粒的定义、命名
（2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌 素抗性基因。
（3）Co1质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠 杆菌素合成的基因。
第三章质粒载体剖析
2、根据质粒是否具有转移功能分为： （1）结合型质粒：分子比较大，拷贝数比较少，且宿主
广。如F质粒 （2）非结合型质粒：分子比较大，拷贝数比较少。如
通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。 理想的状况是，使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA
顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA。
第三章质粒载体剖析
1、氯化铯密度梯度离心法
第三章质粒载体剖析
优点：可获得高纯度、高质量的质粒DNA。 缺点：操作复杂；
价格昂贵（氯化铯）； 设备要求高（超速离心机）； 易造成环境污染和人员伤害（溴化乙锭是一 种极强的诱变剂）
“严紧型”复制控制的质粒。 松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝，
称“松弛型”复制控制的质粒。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受
自身的制约，还受寄主的控制。如ColE1-K30在大肠杆 菌中属松弛型质粒，在奇异变形杆菌中属严紧型质粒。
第三章质粒载体剖析
质粒DNA拷贝数的控制
第三章质粒载体剖析
第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
第三章质粒载体剖析
质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获 得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作 用是分离质粒DNA的关键步骤。
致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅 速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在 一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互 补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状 结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液 中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。
第三章质粒载体剖析
（五）质粒的不亲和性
质粒的不亲和性又称不相容性，是指在没有选择压力 的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同 一寄主细胞系中稳定共存的现象。
能共存于一个细胞中的不同质粒称为亲和质粒。 彼此能够共存的亲和的质粒则是属于不同的不亲和群。
属于同一不亲和群的质粒的亲缘关系上比较接近。如 pMB1的派生质粒（或ColE1派生质粒）。
定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外 的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。
命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发 明者，后接实验编号。如pSC101
第三章质粒载体剖析
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
第三章质粒载体剖析
二、质粒的基本特性
➢ 寄生性 ➢ 质粒DNA的构型 ➢ 质粒DNA分类 ➢ 质粒DNA的复制 ➢ 质粒的不亲和性 ➢ 其他特性
第三章质粒载体剖析
（二）质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）
环形双链DNA质粒分子的三种构型
OC L
SC
第三章质粒载体剖析
不同质粒DNA分子量差异显著，最小的 不足2kb，仅能编码2－3种蛋白质，大 的可达几百kb。
第三章质粒载体剖析
（三）质粒的类型
Hale Waihona Puke Baidu1、根据质粒的性状特征分为：
（1）F质粒：又叫F因子或性质粒。能够使寄主染色体上的 基因和F质粒一起转移到原先不存在该质粒的受体细胞中。
第三章 质粒载体
第一节 质粒载体概况 第二节 质粒DNA的分离与纯化 第三节 质粒载体的构建 第四节 重要的质粒载体 第五节 质粒载体的稳定性问题
第三章质粒载体剖析
第一节 质粒载体的概况
➢ 1、质粒的定义、命名 ➢ 2、质粒的基本生物学特性
第三章质粒载体剖析
克隆载体：通过不同途径能将承载的外源DNA片段（基因）带入受 体细胞，并在其中得以维持的DNA分子。
第三章质粒载体剖析
2、碱裂解法
原理：是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA片断之间， 在拓扑学上的差异发展出来的。
加热或PH介于12.0-12.5的范围内，线性DNA会被变性，两条链会完 全分开。而超螺旋DNA由于双螺旋主链骨架的彼此盘绕作用，互补 的两条链仍会紧密结合在一起，不会被变性。
高拷贝质粒DNA复制的启动，是由质粒编码基因合成的 功能蛋白质调节的，与寄主细胞周期开始时合成的不稳 定的复制起始蛋白质无关。
低拷贝质粒的复制是受寄主细胞不稳定的蛋白质控制的， 并与寄主细胞染色体同步进行。
用蛋白质合成抑止剂氯霉素或壮观霉素处理寄主细胞， 使染色体DNA复制受阻的情况下，松弛的质粒仍可继续 扩增。而严紧型质粒则不行。
第三章质粒载体剖析
分离纯化质粒DNA的程序
第三章质粒载体剖析
3、微量碱变性法提取质粒DNA步骤
离心收集细胞沉淀； 细胞悬浮液重新悬浮细胞； 裂解液使细胞裂解，释放出DNA，同时使DNA变性； 中和液使质粒和染色体DAN复性； 离心除去染色体DNA、蛋白质及RNA等复活物； 含有质粒超螺旋DNA的上清液用酚臭提除去蛋白质； 乙醇沉淀收集质粒DNA。
ColE1质粒 质粒DNA的迁移：由共存的结合型质粒引发的非结合型 质粒的转移过程叫质粒的迁移。 3、显性质粒和隐蔽质粒：如抗性质粒（R质粒）、降解 质粒、Ti质粒。
第三章质粒载体剖析
（四）质粒DAN的复制
质粒的复制受质粒和寄主细胞双重遗传系统的控制。 严紧型质粒：每个寄主细胞仅含有1－3份的拷贝，称
作为克隆载体的DNA分子必须具备的条件： 1、有1至多个克隆位点。供外源DNA片段插入克隆载体DNA分子。 2、能自我复制或整合到染色体DNA上随染色体DNA复制而同步复制。 3、有用于选择重组子的标记基因。 4、载体必须安全，不会任意转入除受体细胞外的其他生物的细胞。
第三章质粒载体剖析
一、质粒的定义、命名
（2）R质粒：通称抗药性因子。编码有一种或数种抗菌 素抗性基因。
（3）Co1质粒 ：产生大肠杆菌素因子。编码有控制大肠 杆菌素合成的基因。
第三章质粒载体剖析
2、根据质粒是否具有转移功能分为： （1）结合型质粒：分子比较大，拷贝数比较少，且宿主
广。如F质粒 （2）非结合型质粒：分子比较大，拷贝数比较少。如
通常的裂解是加入溶菌酶或SDS使大肠杆菌细胞裂解。 理想的状况是，使每个细胞都充分破裂到能使质粒DNA
顺利溢出，而又没有污染过多的染色体DNA。
第三章质粒载体剖析
1、氯化铯密度梯度离心法
第三章质粒载体剖析
优点：可获得高纯度、高质量的质粒DNA。 缺点：操作复杂；
价格昂贵（氯化铯）； 设备要求高（超速离心机）； 易造成环境污染和人员伤害（溴化乙锭是一 种极强的诱变剂）
“严紧型”复制控制的质粒。 松驰型质粒：每个寄主细胞中可高达10－60份的拷贝，
称“松弛型”复制控制的质粒。 质粒究竟是属于严紧型还是松弛型并非绝对，它不仅受
自身的制约，还受寄主的控制。如ColE1-K30在大肠杆 菌中属松弛型质粒，在奇异变形杆菌中属严紧型质粒。
第三章质粒载体剖析
质粒DNA拷贝数的控制
第三章质粒载体剖析
第二节 质粒DNA的分离与纯化
➢ 氯化铯密度梯度离心法 ➢ 碱变性法 ➢ 微量碱变性法 ➢ 影响质粒DNA产量的因素
(1)寄主菌株的遗传背景 (2)质粒的拷贝数及分子大小
第三章质粒载体剖析
质粒作为基因克隆的载体分子，一个重要的条件是获 得批量的纯化的质粒DNA分子。因而寄主细胞的裂解作 用是分离质粒DNA的关键步骤。
致冷或恢复中性PH值，变性处理的质粒和染色体DNA混合物便会迅 速复性。共价闭合环状的质粒DAN，由于两条链在形体上仍保持在 一起，复性迅速准确。随机断裂产生的线性的染色体DNA分子，互 补链彼此已分开，复性就不会那么迅速而准确，它们聚集形成网状 结构，通过离心会与变性的蛋白质及RNA沉淀下来。滞留在上清液 中的质粒DAN则可通过乙醇沉淀法收集。
第三章质粒载体剖析
（五）质粒的不亲和性
质粒的不亲和性又称不相容性，是指在没有选择压力 的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能在同 一寄主细胞系中稳定共存的现象。
能共存于一个细胞中的不同质粒称为亲和质粒。 彼此能够共存的亲和的质粒则是属于不同的不亲和群。
属于同一不亲和群的质粒的亲缘关系上比较接近。如 pMB1的派生质粒（或ColE1派生质粒）。
定义：质粒是一类寄宿于细胞内，独立于染色体外 的自我复制并稳定遗传的环状双链DNA分子。
命名：小写字母p代表质粒，两个大写字母代表发 明者，后接实验编号。如pSC101
第三章质粒载体剖析
大肠杆菌质粒分子的结构示意图
第三章质粒载体剖析
二、质粒的基本特性
➢ 寄生性 ➢ 质粒DNA的构型 ➢ 质粒DNA分类 ➢ 质粒DNA的复制 ➢ 质粒的不亲和性 ➢ 其他特性
第三章质粒载体剖析
（二）质粒DNA分子的三种构型
SC构型: 是指两条多核苷酸链均保持着完整的环形 结构时，称为共价闭合环形DNA(cccDNA)，即超螺 旋的 SC构型。 OC构型: 两条多核苷酸链中只有一天保持完整的环 形结构，另一条出现一至数个缺口时，称开环DNA
(ocDNA)，即OC构型； L构型: 质粒DNA经酶切，发生双链断裂而形成线 性分子(LDNA)，L构型。（见图）