尿砷检测方法的比较

尿砷检测方法的比较

任艳丽1，赫晶红2

1．白城中医院检验科，吉林137000；2．北华大学附属医院检验科中图分类号：R599．9文献标识码：A文章编号：1001－1889（2011）05－0361－03

我国是饮水型和燃煤型地方性砷中毒最严重的国家之一，严重危害人体健康。砷进入人体后主要经肾脏从尿中排出，在尿中的半衰期约为4d［1］。尿砷含量可反映出人体的近期暴露和吸收情况。因此，尿砷是评价砷暴露者中毒程度及代谢能力差异的指标，一直受到国内外广大研究者的重视。测定尿砷的方法很多，有原子荧光光谱法、二乙胺基二硫代甲酸银（DDC －Ag）分光光度法、砷斑法、离子选择电极法、新银盐法、氢化物发生－原子吸收光谱法、电感耦合等离子体发射光谱法（ICP－OES）等等，各种方法均有其优缺点，笔者就几种方法的特点进行概述，供同行参考。

1DDC－Ag分光光度法

该方法的特点是操作繁琐、灵敏度低。尹之全等［2］应用DDC－Ag分光光度法测定砷中毒患者尿样467份，均值为1．843mg/L，标准差为0．2099，其中最高值达14．2mg/L。在应用这个方法过程中发现应注意以下几个方面。

1．1试剂配制（1）实验所用玻璃器材应清洗干净；（2）配制40%氯化亚锡时需在热水浴中加热溶解，定容后再加入数粒金属锡；（3）用10 30目蜂孔状无砷锌粒效果良好；（4）吸收液DDC－Ag最好加氯仿研磨溶解，浓度以0．2% 0．25%为宜。

1．2样品处理取25ml尿样直接加入砷化氢发生瓶中，即直接用砷化氢发生瓶消化尿样，这样可以避免利用三角烧瓶消化完样品再转移入砷化氢发生瓶而造成的砷损失。

1．3砷化氢发生（1）砷化氢发生管插入吸收液的深度，标准管与样品管应保持一致；（2）乙酸铅棉花放人的松紧程度应适中，否则将影响线性；（3）所用锌粒应称量，以4g为宜；（4）在加入锌粒前应用洗瓶沿发生瓶磨口迅速用水湿润一下，这样加入锌粒后立即塞上装有乙酸铅棉花的导气管则起到了水封的作用，防止砷化氢沿磨口间隙冒出；（5）加入碘化钾、氯化亚锡发生瓶内出现黄棕色混浊是硫酸加入过量造成的，这时加入蒸馏水并摇匀，当反应液澄清、透明后可继续下一步操作；（6）当没加入硫酸、碘化钾、氯化亚锡就加

通讯作者：任艳丽，E－mail：408717239@qq．com 入锌粒时，用30ml蒸馏水分3次将反应液洗出并转移至另一发生瓶，倒掉锌粒后继续下一步操作。

1．4比色（1）反应结束后用氯仿补足吸收液至5ml；（2）用氯仿补足吸收液至5ml后，如吸收液颜色很深，超过了线性最高管的颜色，那么用未参与反应的吸收液加以稀释后再比色，并做好稀释记录，以利计算结果。

2石墨炉原子吸收法

石墨炉原子吸收法直接测定尿样中砷即简单又灵敏。但由于尿样基体复杂，干扰严重，存在一些基体的干扰，特别是卤化物的干扰，影响结果的精密度，使石墨炉原子吸收法直接测定尿样中砷受到了限制。曹海兰［3］采用Ni（NO

3

）

2

作为基体改进剂，既提高了灰化温度，又消除了干扰。采用石墨炉原子吸收光谱仪全自动进样，加之选择最佳的干燥、灰化、原子化条件直接测定尿样中砷，不仅提供进样准确度和重现性，减少了测定中的干扰，进一步提高了分析的灵敏度和精密度，消除了石墨管的记忆效应，同时也延长了石墨管的寿命。结果显示，该方法的检出限为1．4μg/L，回收率为92．9% 106．4%，相对标准偏差分别为6．78%、4．59%、3．25%，平均相对标准偏差为4．87%。结论，该方法操作简单、分析速度快、灵敏度高，是一种理想的测定尿样中砷方法。

3氢化物发生－电感耦合等离子体发射光谱法

与其他方法相比，电感耦合等离子体发射光谱法（ICP－OES）灵敏度更高，分析速度更快，特别是与氢化物发生技术（HG）结合后，进一步提高了样品引入效率和检测灵敏度。赵磊等［4］用HG－ICP－OES法检测人尿砷含量，并对该方法进行相关分析效能评价，且与DDC－Ag法进行比较，结果方法检出限为0．21 0．53g/L，定量限2．1 5．3g/L；在10 100g/L范围内，砷浓度与等离子体发射光谱强度线性关系良好（R ＞0．9995），灵敏度（标准曲线斜率）为8．90?0．78；相对标准差在0．42% 1．73%之间，加标回收率95．67% 105．77%，检测结果与DDC－Ag法比较无统计学差异，且检出限更低，灵敏度更高，线性关系更好，精密度区间更窄，回收率范围更可靠，可用于地方性砷

中毒患者尿中总砷含量测定。

4氢化物发生－原子荧光光谱法

氢化物发生－原子荧光光谱法（HG－AFS）具有灵

敏度高、干扰少、操作简便等优点。段景春等［5］用HG －AFS同时测定尿中砷和锑的含量，选择20g/L硼氢化钾（KBH

4

）溶液作为还原剂，50g/L硫脲－50g/L抗坏血酸－50g/L碘化钾混合溶液作为预还原剂，线性范围为0 80μg/L，相关系数r≥0．9995，砷检出限为0．031μg/L，加标回收率为102．3%，RSD为3．45%。结论，该方法简便快速、灵敏度高、准确度好，适合尿液中砷和锑的测定。黄捷玲等［6］采用高压消解器对样品进行消解，用硫脲－抗坏血酸混合剂处理

样品，并以氢氧化钾（KOH）和KBH

4

为还原剂，测定尿中砷和汞。结果砷、汞回收率均大于95%，相对标准偏差小于3%，砷的检出限为0．35μg/L。结论，该方法灵敏度高，检出限低，线性范围宽，操作简便，回收率高，是测定职业人群尿中砷、汞的可靠方法。

5氢化物发生－冷阱捕集－原子吸收法与高效液相色谱－氢化物发生－原子荧光法比较

目前，用于尿砷检测的常规方法主要是高效液相色谱（HPLC）或以冷阱捕集（cold trap）为分离技术，联用原子荧光光谱仪（AFS）、原子吸收分光光谱仪（AAS）或电感耦合等离子质谱仪（ICP－MS）等检测器［7，8］。尽管这两种技术都有检测限低、分离效率高、速度快、污染小等特点，但是在实际使用中却各有特点。

5．1高效液相色谱－氢化物发生－原子荧光法（HPLC －HG－AFS）HPLC是近年发展起来的可以同时分离无机和有机砷化物的方法，其用于砷的形态分析具有较大优势。1974年Tsujii和Kuga将氢化物发生进样技术与原子荧光光谱分析技术相结合，首次实现了氢化物发生原子荧光光谱（HG－AFS）分析，并应用于砷测定。主要是通过调节缓冲溶液的pH值，使砷化物带一定数目的电荷，然后采用不同的色谱方法进行分离，操作简单快捷，可以和检测技术联用实现在线分析，是目前砷形态分析中应用最广泛的分离方法［9］。HPLC与氢化物发生（HG）和原子荧光光谱法（AFS）联用是近几年报道最多的一种砷的检测方法。HG法可以消除生物样品较强的基体干扰，其作用主要是将HPLC分离的目标物气化后，从基体中脱离出来，从而达到能准确测定和分析的目的，目前关于HPLC和HG 连用的报道很多。AFS法作为砷代谢产物的检测方法，是因为原子荧光光谱法具有和电感耦合等离子体质谱（ICP－MS）相当的灵敏度，而仪器价格又远远低于ICP－MS，AFS的谱线简单，选择性好，线性范围宽，且仪器操作快捷、方便［10，11］，而且HG－AFS法和氢化物发生－电感耦合等离子体－原子吸收联用法（HG－ICP－AAS）、HPLC－ICP－MS相比，其分析成本低，为降低背景干扰，目前AFS常和HG联用，在砷形态分析中，HPLCHG－AFS是目前应用最多的联用方法。薛鹏等［12］采用连续流动系统，即经HPLC阴离子柱分离的各种砷化合物进入时刻运行的氢化物发生装置，生成的砷化氢直接进入AFS进行检测，操作极为简便，另外，该方法还可以分析尿中无机砷的价态，而且进样量少，仅为20μl。吴军等［13］采用HPLC－HG－AFS法测定染砷大鼠尿液中砷形态的含量，结果尿样中iAs3+、iAS5+和二甲基砷酸（DMA）3种物质的分离效果较好。该方法具有良好的线性关系，相关系数均大于0．98。灵敏度高、回收率高，平均加标回收率在95．3% 108．4%之间；检出限低，iAs3+、iAs5+和DMA的最低检出浓度分别为12．03、6．67、8．66μg/L，且结果准确。该方法有望应用于其他生物样品（血细胞、脏器样品等）中砷形态的分析，这对于进一步探讨砷代谢与砷毒作用机制间的关系，砷代谢与砷中毒临床表现间的关系及发现剂量－效应关系，都具有重要的理论意义。5．2氢化物发生－冷阱捕集－原子吸收法（HG－old trap－AAS）我国现行的尿砷检测标准方法为DDC－Ag法和HG－AAS法，前者灵敏度低，取样量大；后者线性范围小，而且两法均需要混合酸消化，易产生大量有毒气体，且无法分析尿砷形态［14］，而HG－cold trap－AAS法弥补了这些缺点，可以较好地应用于大样本生物样品中砷元素形态的检测［8，15］。薛鹏等［12］建立的方法，受检尿样未经任何消化处理，大大降低了研究者的工作量并缩短了检测时间。另外，由于进样量少（0．5ml），剩余的样品还可以进行尿肌酐及尿8－OHdG（一种DNA加合物）检测［16］。薛鹏等研究中未检测到三甲基砷氧化物（TMAO），这可能与当地居民的饮食中缺乏海产品人体无法合成TMAO有关，尿中的TMAO全部来自对海洋有机砷的代谢［17］。

5．3两方法的比较薛鹏等［12］对两种方法进行了比较，15份尿样总砷结果差异无统计学意义，但是总砷大于500μg/L的尿样结果差异有统计学意义，即AAS检测器的测定值普遍要高于AFS检测器。这可能由于AAS检测器的线性范围较窄，当尿砷浓度很高时，样品则需要稀释几十倍（本研究中尿液稀释15 60倍）后才能测定，使尿中杂质吸附的砷化合物进一步溶解在稀释的尿液里；而AFS检测器的线性范围较广（约为AAS检测器的十几倍），对于相同样品，尿液稀释的倍数（本研究中尿液稀释0 6倍）要远小于

AAS检测器，此外，尿样过滤也会降低AFS的测定结果。因此，尿砷浓度较高时，AAS法的测定结果更真实。本研究还发现15份尿样甲基砷（MMA）结果差异有统计学意义，这可能与AFS法进样时需要以0．45μm水系滤膜过滤尿样，造成部分吸附在尿中杂质上的砷化合物损失有关，而且MMA在总砷中所占比例小，因而所受影响也较大。

参考文献

［1］WH0．Arsenic and arsenic cmpounds［R］．2nd ed．Environmental Health Criteria224．Gemva：World Health Organization．2001．［2］尹之全，姜严．应用DDC－Ag分光光度法检测尿砷需要注意的几个问题［J］．卫生职业教育，2007，25（4）：113．

［3］曹海兰．石墨炉原子吸收法直接测定尿样中砷［J］．现代预防医学，2008，35（14）：2758 2759．

［4］赵磊，肖婷婷，张爱华．HG－ICP－OES检测尿中总砷含量的方法［J］．黔南民族医专学报，2009，22（1）：9 13．

［5］段景春，边疆，鄣淑英．原子荧光法测定职业病患者尿中砷和锑［J］．中国实用医药，2010，5（11）：268 269．

［6］黄捷玲，老倩群，陈伟东，等．尿中砷和汞的原子荧光分光光度同时测定法［J］．职业与健康，2008，24（21）：2284 2285．

［7］Gong ZL，Lu XF，Ma MS，et al．Arsenic speciation analysis［J］．Talan-ta，2002．58：77 96．

［8］Devesa V，Del Razo LM，Adair B，et al．Comprehensive analysis of ar-senic metabolites by pH－specific hydride generation atomic absorption

spectrometry［J］．J Anal At Spectrom，2004，19：1460 1467．

［9］何小青，陈翁翔，刘湘生，等．在环境科学与生命科学研究中广泛应用的元素形态分析研究进展［J］．分析测试学报，2004，23（2）：

116 120．

［10］杨红丽，王错，朱四喜，等．联用技术在砷形态分析中的应用进展［J］．浙江海洋学院学报（自然科学版），2007，26（1）：65 73．［11］智泉．砷化学形态分析研究进展［J］．山西科技，2006，8（2）：88 89．

［12］薛鹏，富景奇，徐苑苑，等．两种尿砷检测方法的比较［J］．环境与健康杂志，2008，25（7）：624 627．

［13］吴军，王灏，吴顺华，等．砷酸钠（iAs5+）染毒大鼠尿液砷形态分析测定方法探讨［J］．新疆医科大学学报，2010，33（4）：328

331．

［14］程晓天，温新平，王正辉，等．HG－AFS法分析尿砷方法及应用研究［J］．中国地方病学杂志，2007，26（2）：130 132．

［15］Valenzuela0L，Borja－Aburto VH，Gonzalo G，et al．Urinary trivalent methylated arsenic species in a population chronically exposed to in-

organic arsenic［J］．Environ Health Perspect，2005，113：250 254．［16］Yamsuchi H，Aminaka Y，Yoshida K，et al．Evaluation0f DNA dam-age in patients witll arsenic poisoning：urinary8－hydroxydeoxygua-

nine［J］．Toxicol Appl Pharmacol，2004，198：291 296．

［17］Francesconi KA，Tanggaard R，McKenzie CJ，et al．Arsenic metabo-lites in human urine after ingestion of an arsenosugar［J］．Clinical

chemistry，2002，48（1）：92 101．

收稿日期：2011－08－26责任编辑张爱君

·简报·

德中联合研究称德国肠道病系新型病菌引发

德国和中国的一项联合基因研究初步显示，导致最近德国肠出血性大肠杆菌（EHEC）疫情的致病菌是包含2种不同菌种基因的新型病菌。

德国汉堡－埃彭多夫大学医学院细菌专家罗德在接受德新社采访时说，该医学院与中国研究人员的联合研究发现，造成此次肠出血性大肠杆菌疫情的病菌“是常见的肠出血性大肠杆菌的一个非常远的远亲”，它大约80%的基因来自血清型为O104型的大肠杆菌，其余20%的基因来自另外一种大肠杆菌。这一新组合有利于病菌在肠细胞上附着，从而使其能在肠道内宿居更长时间，造成更大的破坏。此外，这种病菌还对抗生素具有很强的抗药性。

世界卫生组织食品安全专家克鲁泽当天也对美联社表示，初步基因组测序结果显示，德国肠出血性大肠杆菌疫情的致病菌是由2种不同大肠杆菌基因结合的突变体，以前从未被发现过。

中国深圳华大基因研究院和德国一家大学2011年6月3日宣布，中德科学家联合对本次流行的病菌进行了全基因组测序，结果显示，该病菌与艾滋病患者腹泻标本中的大肠杆菌同源性超过93%，兼具侵袭、产毒、抗药等多种“凶性”，难以治疗，死亡率偏高。

深圳华大的初步分析结果显示，这次肆虐欧洲的血清型0104大肠杆菌，该病菌带有新型特异基因，与2002年从中非共和国艾滋病患者腹泻标本中分离的肠聚集性大肠杆菌55989菌株，同源性超过93%，同时它还通过基因水平转移，获得肠出血性大肠杆菌的毒力基因和毒力相关质粒，这可能与该菌株强毒性和重症感染有关。

（本刊编辑部张爱君供稿）