第十章亲和色谱汇编
9 亲和色谱
然后把含有目的物质的混合液作为流动相，在 有利于固定相配基与目的物质形成络合物的条 件下进入层析柱。
16
这时，混合液中只
有能与配基发生结合反
应形成络合物的目的物
质（图中· 分子）被吸附。
不能发生结合反应
的杂质分子（图中△分 子）直接流出。
17
经清洗后，选择适当的洗脱液或 改变洗脱条件进行洗脱（图中c），
22
配体的选择：
一对可逆结合的生物分子中与载体相偶 联的一方称配体。如抑制剂，底物，抗体， 辅酶等。
优良配体须具备的条件：
1）与待纯化的物质有较强的亲和力。 2）具有与基质共价结合的基团。
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目的产物与相应的配基
所要分离的目 的产物
酶 抗体 凝集素 激素
相应的配基
底物、抑制剂、辅酶（辅因子） 抗原、病毒、细胞 多糖、糖蛋白、细胞受体 受体、载体蛋白
亲和配基选择（很困难）：
组合化学肽库：小肽亲和配基。
噬菌体展示技术筛选：目标蛋白与噬菌体结合。
SELEX技术筛选：：与蛋白质相匹配的寡核苷酸 6
9.1 生物亲和作用
9.1.2 影响亲和作用的因素
离子强度 pH值
抑制氢键形成的物质
温度 螯合剂
7
9.1 生物亲和作用
9.1.3 亲和作用体系
8
9.2 亲和色谱原理
使被分离物质与固定相配基解离，
即可将目标产物分离纯化。
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9.3 亲和色谱介质
一般情况下，需根据目标产物选择合适 的亲和配基来修饰固体粒子，以制备所需的
亲和吸附介质（固定相）。 固体粒子称为配基的载体。
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作为载体的物质应具有（6点）： ①不溶性的多孔网状结构，渗透性好； ②物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 使用寿命长； ③具有亲水性，无非特异性吸附； ④含有可活化的反应基团，利于亲和配基的固
亲和色谱
过渡金属可形成螯合金属盐固定在固定相离子的 表面，用作亲和吸附的配基，这种利用金属离子 为配基的亲和色谱成为金属螯合亲和色谱或固定 化金属离子色谱
• 组氨酸：弱疏水性、咪唑环为弱电性
在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶 液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着 盐浓度的增大，吸附作用降低。 利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的 蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法
亲和色谱
• 利用生物亲和作用的原理纯化蛋白质的报道最早 见于1910年 • 有意识的利用生物亲和作用纯化蛋白质的研究始 于20世纪50年代初 • 1967年，亲和纯化技术从研究走向实用，出现了 亲和色谱这个名称 • 20世纪80年代以后，利用生物亲和作用的特异性 与其他分离技术相结合
定义
• 生物亲和作用：生物物质，特别是酶和抗 体等活性物质，具有识别特定物质并与该 物质的分子结合的能力。这种能力具有排 他性。生物分子间的这种 特异性相互作用 称为生物亲和作用。 • 亲和分离：利用生物分子间的特异性结合 作用的原理进行生物物质分离纯化的技术
• 肝素 与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体等具有亲和作用。 其亲和作用在中性pH值和低浓度盐溶液中较强
亲和吸附剂及其制备 将亲和配基共价偶联在固体粒子的表面
（孔内）即可制备亲和吸附剂。
制备方法：书 323--325
配基固定化密度：吸附容量、空间位阻 作用 最佳密度值范围
亲和色谱
-间隔臂的作用
生物亲和作用
亲和作用的本质
亲和作用是自然界普遍存在的现象，生物分子间 的亲和作用具有更高的选择性。 蛋白质参与亲和作用的机理还不完全清楚，一般 认为蛋白质的立体结构中含有某些参与亲和结合 的部位，这些结合部位呈凹陷或凸起的结构。
亲和色谱PPT
免疫亲和色谱 固定化金属离子亲和色谱 其他亲和色谱
免疫亲和色谱
免疫亲和色谱(Immunoaffinity Chromatography, IAC)是 利用生物体内存在的抗原、抗体之间高度特异性的亲和 力进行分离的方法。
IAC的特点
1. 2. 3.
专一 高效 灵敏 ……
IAC的应用
1. 2.
抗体的分离纯化——Protein A亲和色谱 快速诊断测试 ……
固定化金属离子亲和色谱
固定化金属离子亲和色谱(Immobilized Metal ion Affinity Chromatography, IMAC) 主要根据蛋白质中组氨酸、色氨酸或半胱氨酸等氨基酸 残基与色谱柱上的金属离子螯合作用形成络合物，从而 实现分离 产物变性 • 渗漏
谢谢
亲和色谱 Affinity Chromatography
黄岳
生研1502
亲和色谱概述
概念：利用生物分子间专一的亲和力而进行分离的一种色谱技术
原理和基本过程
原理：将具有亲和力的两个分子中一个固定在不溶性基质 上，利用分子间亲和力的特异性和可逆性，对另一个分子 进行分离纯化。
亲和色谱的类型
1. 2. 3.
配基稳定性高 ，不易脱落 金属离子配基价格低廉 ，再生成本低 省去了脱盐的预处理步骤 容易洗脱目标蛋白
IMAC的应用——Ni-Agarose His标签蛋白纯化技术
其他亲和色谱技术
生物亲和色谱 拟生物亲和色谱 分子对亲和色谱 共价亲和色谱 凝集素亲和色谱 ……
亲和色谱需要考虑的问题
亲和色谱
Chitin
Trypsin
A
B
C&D
以凝胶电泳检验亲和色谱 操作过程各步骤样品→
Ate 吸附剂：
羟基磷灰石
(Ca5(PO4)3OH)2
可选择 NaCl 或 磷酸 等不同洗脱条件
Bio-Rad CHT
●疏水性层析法：
●●●●● ●●●
-NH2
●● ● ●
硫醇基 -SH
X
■ 可与各种配体基团反应的载体：
配体基团 親 和 性 载体
CNBr-activated Sepharose 4B
Pharmacia
反应方式
直接反应 加 EDC*
反应基团
-C≡N -COOH N-OH-succinimide Oxirane环氧己烷
■ Hydrophobic interaction 色析法：
Ammonium sulfate (% sat.) 25
0 10
Protein concentration
20
15
20
10
5
30
40
50
100
200
300
400
Elution volume (mL)
Pharmacia HIC
Ethylene glycol (%)
亲和色谱(AC)
（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定相表面存在的 某种特异性亲和力，进行选择性分离。 先在载体表面键合上一种具有一般反应 性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接 上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将 只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作 用而被保留。改变淋洗液后洗脱。 亲和洗提 酶与其它化合物一起吸附到一种离子交换剂 上，然后用适当的底物特异地洗提。
1.第十章 色谱法概论
原因：浓度差
原因：柱填充不均匀
：弯曲因子，反映固定相颗 粒对分子扩散的阻碍。
（柱中扩散有阻碍， ＜1)
组分向“塞子”前后扩散， 使区带展宽。
结论：填充均匀，dp合适
29
Dm：组分在流动相中的扩散系 数。
30
5
Dg-组分在载气中的扩散系数 ①时间t长（u小），H大 ②T柱温高，Dg大，H大 ③
正常峰0.95-1.05
9 10
2.2 柱效参数
2.3 定性参数
标准差(σ)：即0.607倍峰高处的峰宽之半。 σ越大，组分越分散。 半峰宽 (W1/2)：峰高一半处的峰宽。 W1/2=2.355σ 峰宽 (W)：色谱峰两侧拐点作切线在基线上 所截得的距离。 W=4σ 或W=1.699W1/2
＝
2(t R 2 t R1 ) W1 W2
m
m
m
容量因子与保留时间的关系：
k
' tR tM tR tM tM
tR=tM(1+ k)
17 18
3
分离度
三、色谱法的基本理论
塔板理论——热力学理论，组分分 离与热力学过程有关，与K，k有关 解释组分在色谱柱内的分离过程。 速率理论——动力学理论，色谱峰 扩散与动力学过程有关。 解释影响柱效（n，H）的因素
12
2
保留体积(VR)：从进样开始到某个组分在柱后 出现浓度极大时，所需通过色谱柱的流动相体 积。
调整保留体积：由保留体积扣除死体积后的 体积
VR t R Fc
注意：VR’是定值，tR’与FC成反比 •相对保留值(r r) ： 两组分的调整保留值之比
死体积(V0)：由进样器至检测器的流路中未被 固定相占有的空间。 固定相颗粒间间隙、导管的容积、检测器内腔 容积的总和。
亲和色谱
双环氧法(p140-145)
产生亲水连接臂，不带电荷，稳定，偶联配体 数量少于溴化氰法
二乙烯砜法
反应性能强，适合于偶联羟基配体；剧毒，昂贵
N,N’-二琥珀酰亚胺碳酸酯法
稳定，不带电荷
有机磺酰氯法 对甲苯磺酰氯、三氟代乙磺酰氯
可释放生色基团，可用于监测偶联反应
碳化二亚胺交联法
其他方法
第三节 亲和层析载体
一、作为载体的条件 1.亲水 2.惰性 3.具有活化基团 4.大网孔 5.机械性能好
二、载体的选择
1.琼脂糖凝胶： 亲水性强，理化性质稳定 （商品名：Sepharose） 2.聚丙烯酰胺凝胶： 理化性质稳定，耐有机溶剂及去污 剂， 抗微生物能力强， 特别适应用配基与提取物亲和力 比较弱的物质。 3.葡聚糖凝胶： 有良好的化学及物理性质，孔径小。 4.纤维素： 非特异吸附严重，廉价，易得。 5.多孔玻璃 ：物理性能好，有非特异性吸附。
聚丙烯酰胺-琼脂糖 多孔玻璃
1,6-己二胺, 6-氨基己酸 氨基丙基, 氨基己基
第四节 亲和吸附剂的制备
一、要求 ㈠. ㈡. 结 L与基质结合，对L-S结合无干扰； L为小分子有的需“手臂”，使L-S
合更有效； ㈢. 非专一吸附不大，以免吸附杂质； L与基质结合稳定（吸附、洗脱、再生）。
二、
偶联用Gel的选择 需考虑： ㈠. L上可供偶联的基团 ㈡. “手臂” ㈢. L的稳定pH
亲和层析洗脱时常用的促溶剂有1～3mol/L硫氰 化钾、1～3mol/L碘化钾、4mol/L MgCl2 使用蛋白质变性剂 8mol/L尿素，6mol/L盐酸胍
Step elution
Gradient elution
专一洗脱(亲和洗脱)
使用配体，如：用不同的核苷酸将脱氨酶 从染料柱上洗脱 使用能与配体结合的分子，如：用游离糖 将糖蛋白从凝集素柱上洗脱 优点：洗脱条件温和，目标分子不会变性 缺点：价格昂贵，配体与目标分子结合后 需要进一步分离
第10章-亲和与印迹分离技术
亲和配基与配体的相互作用
静电 作用
配体
H H
氢键
配基
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疏水 作用
changes of the chemical structure of the membranes surface
W(%) C F O N
Unmodifica 55. 38.3 5.6 0.6
ted
• 可减小空间位阻，增大亲和容量； • 间隔臂一般为基质与配基间的长链分子； • 间隔臂长度要适当，过短起不到减小空间
位阻的作用，过长会弯曲封闭膜上的相邻 的活性位； • 一般取含六个碳原子的化合物：己二胺、 6-氨基己酸等。
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间隔臂种类
疏水性间隔臂 己二胺
亲水性间隔臂 1，3-二氨基-2-丙醇、 小肽、 低聚甘氨酸 聚（L-赖氨酸）等。
间隔臂的亲、疏水性对配基的亲和力大小 及特异性吸附能力影响。
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配基的种类
• 生物特异性配基
生物特异性配基是指利用自然界中特异性相互作 用生物物质对之一做配基，如酶-底物、酶-抑制 剂、激素-互补接受体、抗体-抗原等。
• 基团特异性配基
基团特异性配基是指对具有某一类基团或结构 的生物大分子均有特异性作用的配基，如氨基酸 、蛋白质A、活性染料、金属螯合离子等。
－
HDA grafted
(532.12) 100
(532.12) 100
－
Affinity
(530.73) 20.39 (532.17) 79.61
－
membrane
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亲和膜的制备过程
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活化方法
1. 环氧氯丙烷活化法 2. 1,1’-羰基双咪唑（CDI ）法 3. 三氯三嗪法 4. 过碘酸钠法 5. 戊二醛法 • 双环氧试剂活化法
亲和色谱的原理及应用
亲和色谱的原理及应用1. 亲和色谱的基本原理亲和色谱（Affinity chromatography）是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，基于物质在特定条件下与特异性的配体之间的亲和力相互作用。
它利用生物大分子与某种特定配体之间的选择性相互作用，将目标分子从复杂的混合物中分离出来。
2. 亲和色谱的工作原理亲和色谱的工作原理基于目标分子与固定相上的配体之间的特异性亲和作用。
以下是亲和色谱的基本步骤：1.固定相制备：在某种合适的固定相上固定配体，通常使用大孔吸附树脂、高分子凝胶或亲和层析介质。
2.样品处理：将含有目标分子的混合物与固定相接触，使得目标分子与配体结合。
3.非特异结合物洗脱：通过洗脱步骤，去除与固定相上的配体无关的非特异结合物，以提高目标分子的纯度。
4.目标分子洗脱：利用改变条件的方式打断目标分子与配体的结合，使目标分子从固定相上洗脱出来。
3. 亲和色谱的应用领域亲和色谱广泛应用于生物科学的各个领域，以下是一些常见的应用领域：•蛋白质纯化：亲和色谱是蛋白质纯化中最常用的方法之一。
可以利用靶蛋白与配体的特异性结合进行纯化。
•抗体纯化：亲和色谱也常用于抗体的制备和纯化，通过抗原与抗体的特异性结合来实现。
•肽片段分离：亲和色谱可以用于肽段的富集和分离，通过将特定的配体固定在固定相上，然后与目标肽段进行亲和结合。
•糖类分析：亲和色谱也可用于糖类分析，通过固定配体选择性地结合特定的糖类。
•核酸纯化：亲和色谱也被广泛应用于核酸纯化，通过将亲和分子（如亲和标签等）引入目标核酸或特定的配体与核酸结合，进行纯化。
4. 亲和色谱的优势和局限性亲和色谱具有以下优势：•高选择性：亲和色谱利用特异性的亲和分子与目标分子之间的相互作用力，具有很高的选择性。
•高纯度：亲和色谱可以将目标分子高效地分离纯化，得到高纯度的产物。
•广泛适用性：亲和色谱可以应用于各种生物大分子的分离和纯化。
然而，亲和色谱也存在一些局限性：•结合条件：亲和色谱需要优化和控制结合条件，以确保目标分子与配体之间的结合。
第十章：色谱技术
知识要求 掌握：色谱基本原理、基本概念； 生物药品的常用吸附色谱、反相色谱、 离子交换色谱以及亲和色谱等 熟悉：各种色谱技术中常用的色谱 固定相 了解：各类色谱技术的应用领域
第一节 色谱技术概述
1、色谱技术又称为层析技术,是一 种物理化学分析方法. 2、原理：当溶质在两相间(固定相和流动 相)做相对移动时, 利用混合物中个物质 在两相间分配系数的差别, 各物质在两 相间进行多次分配 ,从而使各组分得到 分离.
②湿法装柱
1. 先在吸附剂中加入合适量的色谱最初用洗脱剂 调成稀糊状 2. 把放好棉花、沙子或合适大小的玻璃砂芯的色 谱柱下口打开，然后徐徐将制好的糊浆灌入柱 子。
3. 让吸附剂自然下沉。当洗脱剂刚好覆盖吸附剂
平面时，关紧下口活塞。
•
注意：整个操作要慢，不要将气泡压入吸附剂
中，而且要始终保持吸附剂上有溶剂
二、基本概念
（一）概述 液相色谱主要通过目标组分或待分离物 在两相间的分配能力或作用力不同而使 ！ 目标组分得以分离，其中一相保持不动 ，称为固定相，而另一相移动，称为流 动相
柱色谱
洗脱液
样品 填充物 玻璃柱
分部收集
1. 色谱柱 • 色谱柱通常用玻璃柱。工业上大型色谱柱可以 用金属制造。
• 柱的入口端应该有进料分步器，使进入柱内的
流动相分布均匀。
• 有时也可在色谱柱顶端加一层多孔的尼龙圆片
或保持一段缓冲液层。 • 柱的底部可以用玻璃棉，也可以用砂芯玻璃板 或玻璃细孔板支持固定相。
设计柱长时需考虑下列几点：
(1)柱的最小长度取决于所要达到的分离程度 (2)较大的柱直径需要较长的色谱柱。
(3)柱越长，长度和内径比越大，就越难 得到均匀的填装。大多数色谱柱的长度 25cm左右。
《亲和色谱》课件
生物工程技术
利用生物工程技术改造蛋白质 或酶，提高亲和色谱的特异性
。
光学检测技术
结合光学检测技术，实现高灵 敏度、高分辨率的亲和色谱分
析。
亲和色谱在各领域的应用前景
生物医药领域
用于蛋白质、细胞、病毒等生物分子 的分离和纯化，为药物研发和疾病诊 断提供支持。
环境监测领域
用于水体、土壤、空气等环境样品中 污染物的分离和检测，为环境治理和 保护提供依据。
农药残留检测
亲和色谱可用于农药残留的检测，通过与农药分 子的特异性结合，实现对农药残留的高灵敏度检 测。
食品营养成分分析
亲和色谱可用于食品营养成分的分析，如维生素 、矿物质等，通过与特定配基的结合，实现对营 养成分的高效分离和检测。
亲和色谱在环境监测领域的应用案例
有毒有害物质检测
亲和色谱可用于有毒有害物质的检测，如重金属、有机污染物等， 通过与特定配基的结合，实现对有毒有害物质的高灵敏度检测。
食品安全领域
用于食品中农药残留、添加剂、毒素 等有害物质的检测和分离，保障食品 安全。
农业领域
用于植物生长调节物质、农药残留等 的分离和检测，促进农业可持续发展 。
亲和色谱的发展趋势和未来展望
智能化发展
通过自动化、智能化技术，提高亲和色谱的 分离效率和准确性。
高通量、高分辨率
开发高通量、高分辨率的亲和色谱技术，满 足大规模样品分析的需求。
稳定性差
亲和色谱的配体和载体在某些条件下可能不稳定，影 响实验结果。
适用范围有限
亲和色谱的适用范围相对较窄，仅适用于具有特异性 相互作用的目标分子。
亲和色谱的改进方向
开发通用型配体
通过研究不同类型分子间的相互作用，开发 出适用于多种目标分子的通用型配体，降低 实验成本。
亲和色谱法的原理及应用
亲和色谱法的原理及应用一、亲和色谱法的原理亲和色谱法是一种利用生物大分子间的特异性相互作用进行分离和纯化的方法。
其原理是通过靶分子与固相上的配体之间产生亲和结合来实现分离。
亲和色谱法利用了配体与靶分子之间的特异性相互作用，如抗原与抗体的结合、酶与底物的结合等，从而实现对目标分子的选择性捕获。
其分离和纯化效果优于传统的分离方法，成为现代生物科学研究中不可或缺的技术手段。
二、亲和色谱法的应用亲和色谱法在生物学和药物研发等领域中有着广泛的应用。
下面列举了一些常见的应用案例：1.抗体纯化：亲和色谱法广泛应用于抗体的纯化工艺中。
通过将抗体的抗原特异性与配体结合，可以实现对抗体的高效选择性纯化。
2.蛋白质纯化：亲和色谱法在蛋白质纯化中起到了重要的作用。
通过将某一特定结合配体固定在色谱柱上，可以实现对目标蛋白质的选择性捕获。
3.酶底物亲和纯化：亲和色谱法可利用酶与底物之间的亲和结合进行酶的纯化。
通过将底物或类似物固定到色谱柱上，可实现对酶的选择性捕获。
4.核酸纯化：亲和色谱法可应用于核酸的纯化过程。
通过将亲和配体固定在色谱柱上，可以实现对目标核酸的高效分离。
5.生物药物开发：亲和色谱法在生物药物的开发过程中起到关键作用。
通过分离和纯化目标蛋白质，可以获得高纯度的生物药物。
三、亲和色谱法的优势和局限性使用亲和色谱法进行分离和纯化具有以下优势：•高选择性：亲和色谱法可以实现对目标分子的高度选择性捕获，减少了其他杂质的干扰。
•高纯度：亲和色谱法可以获得高纯度的目标分子，满足进一步研究和应用的需要。
•原位纯化：亲和色谱法能够在原位进行纯化操作，避免了传统离心、沉淀等分离步骤。
然而，亲和色谱法也存在一些局限性：•配体选择性：亲和色谱法的成功与否，取决于配体与靶分子之间的相互作用是否特异、强烈，因此选择合适的配体是亲和色谱法的关键。
•杂质的干扰：亲和色谱法在分离和纯化过程中，有时可能会受到杂质的干扰，导致目标分子的选择性捕获不够理想。
亲和色谱法affinity chromatography.doc
亲和色谱法affinity chromatography离子交换色谱法ion exchange chromatography，IEC离子色谱法ion chromatography离子抑制色谱法ion suppression chromatography离子对色谱法ion pair chromatography疏水作用色谱法hydrophobic interaction chromatography制备液相色谱法preparative liquid chromatography平面色谱法planar chromatography纸色谱法paper chromatography薄层色谱法thin layer chromatography，TLC高效薄层色谱法high performance thin layer chromatography，HPTLC 浸渍薄层色谱法impregnated thin layer chromatography凝胶薄层色谱法gel thin layer chromatography离子交换薄层色谱法ion exchange thin layer chromatography制备薄层色谱法preparative thin layer chromatography薄层棒色谱法thin layer rod chromatography液相色谱仪liquid chromatograph制备液相色谱仪preparative liquid chromatograph凝胶渗透色谱仪gel permeation chromatograph涂布器spreader点样器sample applicator色谱柱chromatographic column棒状色谱柱monolith column monolith column微粒柱microparticle column填充毛细管柱packed capillary column空心柱open tubular column微径柱microbore column混合柱mixed column组合柱coupled column预柱precolumn保护柱guard column预饱和柱presaturation column浓缩柱concentrating column抑制柱suppression column薄层板thin layer plate色谱图chromatogram色谱峰chromatographic peak峰底peak base峰高h，peak height峰宽W，peak width半高峰宽Wh/2，peak width at half height峰面积A，peak area拖尾峰tailing area前伸峰leading area假峰ghost peak畸峰distorted peak反峰negative peak拐点inflection point原点origin斑点spot区带zone复班multiple spot区带脱尾zone tailing基线base line基线漂移baseline drift基线噪声N，baseline noise统计矩moment一阶原点矩γ1，first origin moment二阶中心矩μ2，second central moment三阶中心矩μ3，third central moment液相色谱法liquid chromatography，LC液液色谱法liquid liquid chromatography，LLC液固色谱法liquid solid chromatography，LSC正相液相色谱法normal phase liquid chromatography反相液相色谱法reversed phase liquid chromatography，RPLC柱液相色谱法liquid column chromatography高效液相色谱法high performance liquid chromatography，HPLC 尺寸排除色谱法size exclusion chromatography，SEC凝胶过滤色谱法gel filtration chromatography凝胶渗透色谱法gel permeation chromatography，GPC浓缩区薄层板concentrating thin layer plate荧光薄层板fluorescence thin layer plate反相薄层板reversed phase thin layer plate梯度薄层板gradient thin layer plate烧结板sintered plate展开室development chamber往复泵reciprocating pump注射泵syringe pump气动泵pneumatic pump蠕动泵peristaltic pump检测器detector微分检测器differential detector积分检测器integral detector总体性能检测器bulk property detector溶质性能检测器solute property detector(示差)折光率检测器[differential] refractive index detector荧光检测器fluorescence detector紫外可见光检测器ultraviolet visible detector电化学检测器electrochemical detector蒸发(激光)光散射检测器[laser] light scattering detector光密度计densitometer薄层扫描仪thin layer scanner柱后反应器post-column reactor体积标记器volume marker记录器recorder积分仪integrator馏分收集器fraction collector工作站work station固定相stationary phase固定液stationary liquid载体support柱填充剂column packing化学键合相填充剂chemically bonded phase packing薄壳型填充剂pellicular packing多孔型填充剂porous packing吸附剂adsorbent离子交换剂ion exchanger基体matrix载板support plate粘合剂binder流动相mobile phase洗脱(淋洗)剂eluant，eluent展开剂developer等水容剂isohydric solvent改性剂modifier显色剂color [developing] agent死时间t0，dead time保留时间tR，retention time调整保留时间t'R，adjusted retention time死体积V0，dead volume保留体积vR，retention volume调整保留体积v'R，adjusted retention volume柱外体积Vext，extra-column volune粒间体积V0，interstitial volume(多孔填充剂的)孔体积VP，pore volume of porous packing 液相总体积Vtol，total liquid volume洗脱体积ve，elution volume流体力学体积vh，hydrodynamic volume相对保留值ri.s，relative retention value分离因子α，separation factor流动相迁移距离dm，mobile phase migration distance流动相前沿mobile phase front溶质迁移距离ds，solute migration distance比移值Rf，Rf value高比移值hRf，high Rf value相对比移值Ri.s，relative Rf value保留常数值Rm，Rm value板效能plate efficiency折合板高hr，reduced plate height分离度R，resolution液相载荷量liquid phase loading离子交换容量ion exchange capacity负载容量loading capacity渗透极限permeability limit排除极限Vh，max，exclusion limit拖尾因子T，tailing factor柱外效应extra-column effect管壁效应wall effect间隔臂效应spacer arm effect边缘效应edge effect斑点定位法localization of spot放射自显影法autoradiography原位定量in situ quantitation生物自显影法bioautography归一法normalization method内标法internal standard method外标法external standard method叠加法addition method普适校准(曲线、函数) calibration function or curve [function]谱带扩展(加宽) band broadening(分离作用的)校准函数或校准曲线universal calibration function or curve [of separation] 加宽校正broadening correction加宽校正因子broadening correction factor溶剂强度参数ε0，solvent strength parameter洗脱序列eluotropic series洗脱(淋洗) elution等度洗脱gradient elution梯度洗脱gradient elution(再)循环洗脱recycling elution线性溶剂强度洗脱linear solvent strength gradient程序溶剂programmed solvent程序压力programmed pressure程序流速programmed flow展开development上行展开ascending development下行展开descending development双向展开two dimensional development 环形展开circular development离心展开centrifugal development向心展开centripetal development径向展开radial development多次展开multiple development分步展开stepwise development连续展开continuous development梯度展开gradient development匀浆填充slurry packing停流进样stop-flow injection阀进样valve injection柱上富集on-column enrichment流出液eluate柱上检测on-column detection柱寿命column life柱流失column bleeding显谱visualization活化activation反冲back flushing脱气degassing沟流channeling过载overloading。
色谱分离技术—亲和色谱分离技术
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 辅酶和磷酸腺苷
某些酶需要在辅酶存在的情况下才能表现出催化活性，即辅酶能与脱氢酶 和激酶之间通过亲和作用相互结合，因此这些辅酶可用作脱氢酶和激酶的亲和 配基。
主要的辅酶有NAD、NADP、ATP。
亲和层析介质
亲和配基
常用的亲和配基： 过度金属离子
铜、镍、锌等可与氮、硫、氧等供电原子产生配位键，因此可与蛋白质表 面的组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸吲哚基发生亲和结合作用。
的亲和能力有决定性影响。
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化（样品制备、装柱、平衡） 2.亲和吸附 3.解吸附 4.色谱柱再生
亲和色谱法的操作方法
1.配基固相化 将与纯化对象有专一结合作用的物质，连接在水不溶性载体上，制成亲和
吸附剂后装柱（称亲和柱），用一定pH和离子强度的缓冲液对柱子进行平衡。 2.亲和吸附
即进料和杂质清洗。将含有目标产物的料液连续通入亲和柱，目标产物吸 附在柱上，之后用缓冲液淋洗色谱柱除去未被吸附的杂蛋白。
亲和色谱法的操作方法
3.解吸附 解吸附即目标产物洗脱。用某种缓冲液或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和
柱上的目的产物洗脱出来。
亲和色谱法的操作方法
4.色谱柱再生 用几倍体积的起始缓冲液进行再平衡，一般足以使亲和柱再生，但一些未
亲和层析介质
亲和层析介质由载体和配基组成
亲和载体
载体应具备的条件： 1.载体必须具有较好的理化稳定性和生物惰性，非专业吸附小。 2.具有大量可供活化和配基结合的化学基团，以供与配基共价连接之用。 3.载体必须具有高度的水不溶性和亲水性。 4.载体必须有稀松的网状结构使大分子能自由进入。 5.载体要有良好的机械性能，颗粒均匀。
亲和色谱知识简介
亲和色谱原理及其应用陕西科技大学职业技术学院生物化工工艺092班郝少杰20090305247摘要：亲和色谱也称为亲和层析，是液相色谱的一个分支，主要用于生物分子的分离、纯化和分析。
是利用生物分子，特别是生物大分子与亲和色谱固定相表面配位体之间，存在的生物学和生物化学过程的特效性亲和吸附作用，来进行选择性分离生物分子的分离方法。
至今，亲和色谱已在生物化学、分子生物学、基因组学、蛋白质组学、生物工程、临床医学、新型高效药物研究中，成为常规的分离、分析和制备的有效工具，并且在生物大分子的结构、功能研究中，成为一种普遍采用的方法。
关键词：亲和色谱，分离方法，纯化，普遍采用的方法。
一、亲和色谱的原理生物大分子（肽、蛋白质、核酸等）的一个共同特性，是它们具有以特有的高效方式去识别或键合到其他分子上的能力，这就使得所有的生物大分子，可借助亲和作用过程来进行分离和纯化。
将一对能可逆结合和解离生物分子的一方作为配基（也称为配体），与具有大孔径、亲水性的固相载体相偶联、制成专一的亲和吸附剂，再用此亲和吸附剂填充色谱柱，当含有被分离物质的混合物随着流动相流经色谱柱时，亲和吸附剂上的配基就有选择地吸附能与其结合的物质，而其他的蛋白质及杂质不被吸附，从色谱柱中流出，使用适当的缓冲液使被分离物质与配基解吸附，即可获得纯化的目的产物。
二、一般流程亲和色谱分离的通常是混合在溶液中的物质，比如细胞内容物、培养基或血浆等。
待分离的分子在通过色谱柱时被固定相或介质上的基团捕获，而溶液中其他的物质可以顺利通过色谱柱。
然后把固态的基质取出后洗脱，目标分子即刻被洗脱下来。
如果分离的目的是去除溶液中某种分子，那么只要分子能与介质结合即可，可以不必进行洗脱。
三、影响亲和色谱的因素1、上样体积若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积对亲和色谱效果影响较小。
若二者间结合力较弱，样品浓度要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。
2、柱长亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。
亲 和 色 谱
亲和色谱中两个进行专一结合的分子互称 对方为配基。如抗原和抗体，抗原可认为是 抗体的配基，反之抗体也可认为是抗原的配 基。将一个水溶性配基在不伤害其生物学功 能的情况下与水不溶性载体结合称为配基的 固相化。亲和色谱法的基本过程是： 1.配基 固相化。将与纯化对象有专一结合作用的物 质，连接在水不溶性载体上，制成亲和吸附 剂后装柱（称亲和性）。
亲和色谱分离的方法随每种分离物质的不同 而有不同。一般推荐使用的程序如下： 1.选 择配基；2.选择偶联凝胶；3.偶联配基；4. 装填合适的柱；5.平衡（2-3倍体积缓液）； 6.应用样品；7.洗涤未结合物质；8.洗 脱结合物质→除盐；9.再生
解离常数 ：
• 药物与结合位点(受体)的结合反应中，药物
与结合位点复合物解离的平衡常数，与药 物和结合位点间的亲和力成反比。
亲 和 色 谱
一、基本理论 二、实验方法
一、基本理论
（一）原理
在生物体内，许多大分子具有与某些相对 应的专一分子可逆结合的特性。例如抗原 和抗体、酶和底物及辅酶、激素和受体、 RNA和其互补的DNA等，都具有这种特性。 生物分子之间这种特异的结合能力称为亲 和力，根据生物分子间亲和吸附和解离的 原理，建立起来的色谱法称亲和色谱法。
选择配基有两条标准：第一是蛋白质和配基之间 必须有强的亲和力，解离常数在5mM以上不是好 配基； 相反亲和力太高也是有害的，因为在解离 蛋白质──配基复合物时所需的条件就要强烈， 这样可能使蛋白质变性。例如用抗生物素蛋白作 配基纯化含生物素的羧化酶时，生物素──抗生 物素蛋白复合物的解离常数达10-15M，解离时需 要pH1.5，6M盐酸胍，在这种条件中羧化酶大多 数已经变性；第二是，配基必须具有适当的化学 基团，这种基团不参与配基与蛋白质之间特异结 合，但可用于活化和载体相连接，同时又不和吸附。将含有纯化对象的混合物通 过亲和柱，纯化对象吸附在柱上，其他物 质流出色谱柱。 3.解吸附。用某种缓冲液 或溶液通过亲和柱，把吸附在亲和柱上的 欲纯化物质洗脱出来。
亲和色谱
亲ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ层析原理图
影响亲和色谱的因素
• 1、上样体积 若目标产物与配基的结合作用较强，上样体积 对亲和色谱效果影响较小。若二者间结合力较弱，样品浓度 要高一些，上样量不要超过色谱柱载量的5%~10%。 • 2、柱长 亲和柱的长度需要根据亲和介质的性质确定。如果 亲和介质的载量(同上 求解释T ^T)高，与目标产物(目标物)的 作用力强，可以选择较短的珠子(柱子);相反，则应该增加柱 子的长度，保证目标产物与亲和介质有充分的作用时间。 • 3、流速 亲和吸附时目标产物与配基之间达到结合反应平衡 需要一个缓慢的过程。因此，样品上柱的流速应尽量的慢， 保证目标产物与配基之间有充分的时间结合，尤其是二者间 结合力弱和样品浓度过高时。 • 4、温度 温度效应在亲和色谱中比较重要，亲和介质的吸附 能力受温度影响，可以利用不同的温度进行吸附和洗脱。一 般情况下亲和介质的吸附能力随温度的升高而下降，因此在 上样时可选择较低的温度，使待分离物质与配基有较大的亲 和力，充分地结合;而在洗脱时刻采用较高的温度，使待分离 物质与配基的亲和力下降，便于待分离物质从配基上脱落。 例如，一般选择在4℃进行吸附，25℃下进行解
亲和色谱法
生物工程领域 2016-6-13
生物亲和作用
• 定义：生物物质，特别是酶和抗体等蛋白 质，具有识别特定物质并与之相结合的能 力。这种识别并结合的能力具有排他性， 即生物分子能够区分结构和性质非常相近 的其他分子，选择性地与其中一种分子相 结合。这种特异性的相互作用称为生物亲 和作用（bioaffinity）或简称亲和作用 (affinity)。
例：抗原抗体的特异性结合
电镜图片
抗原抗体结合示意图
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亲和柱色谱
2011-6-20 5
二.亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在载体的表面或孔内即可 制备亲和吸附介质。 制备亲和吸附介质。 理想载体应当具备以下性质 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附， 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附，比表面 积大; 积大; 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度， 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度，使用 寿命长; 寿命长; 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化; 含有可活化的反应基团，用于亲和配基的固定化; 粒径均一的球形粒子。 粒径均一的球形粒子。 亲和色谱的载体主要有琼脂糖、纤维素、 亲和色谱的载体主要有琼脂糖、纤维素、葡聚 糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃等。 糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶、多孔玻璃等。
2011-6-20 9
④洗脱 特异性洗脱 洗脱剂中含有与亲和配基或目标产物具 有亲和作用的小分子化合物， 有亲和作用的小分子化合物，通过这些小 分子化合物与亲和配基或目标产物的竞争 性结合，脱附目标产物。 性结合，脱附目标产物。 特异性洗脱法的洗脱条件温和， 特异性洗脱法的洗脱条件温和，有利于 保护目标产物的生物活性。 保护目标产物的生物活性。
2011-6-20
8
②料液流速 ③清洗 清洗操作的目的是洗去吸附介质内部 及柱空隙中存在的杂质， 及柱空隙中存在的杂质，一般使用与吸 附操作相同的缓冲液， 附操作相同的缓冲液，必要时加入表面 活性剂， 活性剂，保证目标产物的吸附和杂质的 除去。 除去。 由于亲和吸附是可逆的， 由于亲和吸附是可逆的，清洗过度 会使目标产物的损失增多， 会使目标产物的损失增多，特别是亲和 结合较弱的亲和体系；清洗不充分， 结合较弱的亲和体系；清洗不充分，则 使洗脱回收的目标产物纯度降低。 使洗脱回收的目标产物纯度影响因素 pH和离子强度 ①pH和离子强度 通常预分离料液中目标产物浓度很低， 通常预分离料液中目标产物浓度很低， 而杂质大量存在， 而杂质大量存在，即使只有少量杂质发生 了非特异性吸附， 了非特异性吸附，也会大大降低分离纯化 的效果。 的效果。 一般来说， 一般来说，杂质的非特异性吸附量与 其浓度、性质、材料、 其浓度、性质、材料、配基固定化法以及 缓冲液的离子强度、pH和温度等因素有关 和温度等因素有关。 缓冲液的离子强度、pH和温度等因素有关。
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配基
生物特异性配基 拟生物亲和配基
亲和配基必须具备的条件： 1、专一性识别或特异性作用必须是可逆的 2、结合常数要适当 3、稳定性好，可进行化学改性
专一性和特异性决定着分离纯化的产品纯度 相互作用的强弱决定着吸附和解吸的难易程度
亲和配基的分类
单专一性的小分子配基 基团专一性的小分子亲和配基 专一性的大分子亲和配基 免疫亲和配基 基团专一性的大分子亲和配基
亲和色谱介质的制备
基质的选择
理想的基质应符合下面的要求： 1．极低的非特异性吸附 2．高度的亲水性 3．较好的理化稳定性
4．大量的化学基团能被有效地活化，而且容易和配 体结合
5．适当的多孔性 一般亲和吸附剂采用的基质有纤维素、聚丙烯酰 胺凝胶、交联葡聚糖、琼脂糖、交联琼脂糖、多 孔玻璃珠等。
配基的选择
结合作用的小分子化合物，通过与亲和配基或目标 产物的竞争性结合，洗脱目标产物。 非特异性洗脱通过调节洗脱液的pH、离子强度、 离子种类或温度等降低目标产物的亲和吸附作用。
亲和色谱
亲和层析(Affinity Chromatography，AC)是利用 生物大分子具有对一类生物大分子特异识别和可 逆结合的特性而建立起来的一种分离的色谱方法， 也叫做生物亲和或生物特异性亲和色谱。
生物分子间的亲和识别包括抗体-抗原、酶-底物、 激素-受体等亲和作用。
具有亲和作用的分子对之间具有“钥匙”和“锁 孔” 的空间结构关系。
亲和结合作用，至少存在3个对应官能团相结合： 静电作用 氢键 疏水相互作用 配位键 弱共价键
影响亲和作用的因素
1、离子强度：一般来说，提高离子强度，亲和作用 减弱或完成破坏。
2、pH：在适当的pH下，亲和结合作用较高，在其 它pH下，亲和作用减弱或完成破坏。
3、抑制氢键形成的物质：脲和盐酸胍的存在可减弱 亲和作用
4、温度：提高温度，静电作用、氢键、配位键减弱； 但是，疏水性相互作用增强
5、液体离子：SCN-、I-、CIO4-的存在，疏水性相 互作用减弱
6、螯合剂：影响配位键，使亲和作用消失
根据配体对待分离物质的亲和性的不同，可以将 其分为两类： 特异性配体（specific ligand） 通用性配体（general ligand）。
特异性配体
特异性配体一般是指只与单一或很少种类的蛋
白质等生物大分子结合的配体。如生物素和亲和 素、抗原和抗体、酶和它的抑制剂、激素－受体 等，它们结合都具有很高的特异性，用这些物质 作为配体都属于特异性配体。
是亲和分离技术中最具优势的方法
平衡Leabharlann 混合蛋白样液品
带有配体的树 脂珠（或胶粒）
含配体溶液
洗下未结合的 蛋白
收集目的蛋 白
亲和作用体系
将亲和体系中的一种分子与固体粒子共价偶联， 可特异性结合另一种分子（目标产物），使其从 混合物中高选择性地分离纯化。
一般将被固定的分子称为其亲和结合对象的配基
（ligand），用L表示。
第十章 亲和色谱
生物分离过程的一般流程
原料液
细胞分离(离心，过滤)
细胞－胞内产物 路线一
路线二 清液－胞外产物
路线一B 包含体
细胞破碎 碎片分离
路线一A
溶解(加盐酸胍、脲)
粗分离(盐析、萃取、超过滤等)
复性
纯化(层析、电泳)
脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤)
精制(结晶、干燥)
一、概述
生物分子能够区分结构和性质非常接近的其他分 子，选择性地与其中某一种分子相结合，生物分 子间的这种特异性相互作用称为亲和作用。
亲和层析的基本特点
1、纯化过程简单、迅速，且分离效率高； 2、特别适用于分离纯化一些含量低、稳定性差
的生物大分子； 3、纯化倍数大，产物纯度高； 4、必须针对某一分离对象制备专一的配基及寻
求稳定的层析条件；
5、价格相对较昂贵； 6、在洗脱中，交联在层析介质上的配基可能脱落并
进入产品中，从而造成不良影响，如抗体、染料 等配基。
配体的特异性是保证亲和层析高分辨率的重要
因素，但寻找特异性配体一般是比较困难的，尤 其对于一些性质不很了解的生物大分子，要找到 合适的特异性配体通常需要大量的实验。
通用性配体
通用性配体一般是指特异性不是很强，能和某
一类的蛋白质等生物大分子结合的配体，如各种 凝集素（lectine）可以结合各种糖蛋白，核酸可 以结合RNA、结合RNA的蛋白质等。
亲和层析过程
找与底物专一可逆 结合的配基；
将配基通过共价键 偶联到基质；
配基与底物吸附； 洗脱目标物。
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二、亲和纯化技术
亲和层析(Affinity chromatography) 亲和过滤（膜分离） 亲和分配（双水相萃取） 亲和反胶团萃取（反胶团萃取） 亲和沉淀（沉淀） 亲和电泳（电泳）
利用生物分子之间的专一性识别或特定的相互作 用进行分离的技术为亲和分离技术
亲和配基是对生物分子具有专一性识别或特定的 相互作用的物质
特异性 高特异性
群特异性
常见亲合作用体系
亲和体系
抗原-单克隆抗体 荷尔蒙－受体蛋白 核酸－互补碱基链段、核酸结合蛋白 酶－底物、产物、抑制剂
免疫球蛋白－A蛋白、G蛋白 酶－辅酶 凝集素－糖、糖蛋白、细胞、细胞表面受体 酶、蛋白质-肝素 酶、蛋白质-活性色素（染料） 酶、蛋白质-过渡金属离子（铜、锌等） 酶、蛋白质－氨基酸（组氨酸等）
Kd解离常数
Keq结合常数
[E]、[L]和[E·L]分别表示蛋白质、配基和其复合 体的平衡浓度。
结合常数Keq越大，或解离常数Kd越小，表示亲和 结合作用越强。Keq一般为104～108 L/mol，有些 最高可达到1015 L/mol 。
低于103 L/mol，亲和结合作用太小，不能有效结 合目标。
亲和配基的选择
组合化学肽库选择亲和配基 目标肽→反义肽→组合合成→亲和筛选→优选序 列
噬菌体展示技术 目标蛋白→可结合噬菌体→扩增→多轮筛选单克 隆群体→氨基酸序列
SELEX技术 随机序列→PCR扩增→特异性结合→重复筛选
亲和洗脱
目标产物的洗脱方法有特异性洗脱和非特异性洗脱。 特异性洗脱剂含有与亲和配基或目标产物具有亲和
通用性配体对生物大分子的专一性虽然不如特