血红蛋白电泳的意义和判断(高级版)

d
b
N HbS HbC SC Compound heterozygoty
Hé Heterozygote té rozygote
d
b
HbA
Hé té rozygote composite SC heterozygote Homozygote compound
Gg
Ag
d
b
D型血红蛋白分子病
常见区域:
常见于印度.
特点:
变异体位置 b121 Glu (谷氨酸,负电荷) →Gln (谷氨酰胺, 不带电荷) (D- Los Angeles = D-Punjab)
(6 different Hb D according to the position of the mutation)
碱性缓冲液中: 电荷下降 → M电泳速度变度变慢,靠近Hb S
At pI=pH, Hb does not have a


net charge and stops migrating

电泳分离效果好, 但时间长. 需要经验丰富才能获得良好 结果及进行结果判断
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介于普通电泳和等电聚焦电泳之间的新方法: - 通过毛细管电泳法, 即可以获得与IEF方法一样 的分辨率,同时检测结果量值Hb A2/Hb F同样精 确. - 出现异常变异体后: 使用下列方法确认: * ITANO test (solubility test) * HPLC液相色谱 * Genotyping基因筛查
临床症状:
轻微贫血
基因纯合体:
基因杂合体:
无症状 (仅在电泳中发现D区带)
Hb A fraction: absence Hb D fraction: 100 %
Hb A fraction: 65 – 70 % Hb D fraction: 30 – 35 %
E型血红蛋白分子病
常见区域:
常见与东南亚地区.
○ 合成或合成调控异常 :
b globin b Thalassemias
globin Thalassemias
合并型 : 血红蛋白分子病Hemoglobinopathies /地贫 Thalassemias
血红蛋白遗传病
遗传性疾病基因学图谱
正常基因
异常基因
异常血红蛋白类型
无
无
-/- - -/ - -/-
无明显临床症状
Hb A : N HbA2 : N (2-3.5%) Hb A and HbA2: N Hb Bart’s 0-3% at birth Confirmation by molecular biology Hb A and HbA2: N Hb Bart’s 2-8% at birth
Hb E fraction: 30 – 35 %
下列情况下,需要进行血红蛋白检测



临床和遗传问题 (产前诊断) 贫血,小红细胞症 新生儿筛查 对来自地贫高发区人口,进行筛查 …
患者临床症状,年龄,籍贯和其他相关的背景
对诊断有帮助的其他信息

(输血记录) 血液全套检测, 网状细胞级别和进行细胞形态镜检 Hb电泳 (EDTA抗凝管) 离子平衡和溶血情况
特点:
变异位点 b26 Glu (谷氨酸,负电荷) →Lys (赖氨酸,正电荷) 碱性缓冲液: 总体带电荷下降 → 凝胶电泳中,出现在HbC附近
临床症状:
基因纯合体:
轻微贫血
杂合体:
无症状
Hb A fraction: absence Hb E fraction: 100 %
Hb A fraction: 65 – 70 %

抗凝管采血 (EDTA, heparin, citrate). 如果需 要对输血患者采血, 需要在输血前采集血液. 使用去除血浆后的红细胞(隔夜或5000 rpm,5 分钟离心后样品) + 4°C以上, 标本最多存放 7 天. 需要长期存放, 可以洗涤红细胞后,放置于 80°C (可存放至少 3个月)
血红蛋白疾病的区域分布图
Thalassemias
Beta 地中海贫血
bo 没有Beta链合成 b+ 合成能力下降
o
常见区域
常见与地中海区域: 意大利, 西班牙,希腊, 近东地区, 非洲北部. 同样常见于东南亚 : 泰国,印度, 越南,中国, 印尼.
o
临床症状
* Beta 地贫重症型 - 严重贫血 (需要长期输血治疗) * Beta 地贫中间型 * Beta 地贫轻微型 - 无临床症状
新生儿
血红蛋白遗传病类型 (HEMOGLOBINOPATHIES) ?

血红蛋白疾病
血红蛋白性质变化 : 血红蛋白分子病
○ 结构异常, 一个或数个氨基酸变异或缺失, 都将会导致血红蛋
白分子的电性发生改变 ○ 常见血红蛋白变异体
b-globin : S – C – DPunjab – E…
血红蛋白含量变化 : 地中海贫血
目的

血红蛋白结构和功能的回顾 Sebia CAPILLARYS 2 / Minicap血红蛋白检测说明 血红蛋白临床结果说明


2
血红蛋白的结构
血红蛋白分子是由4条多肽链(2对)和4个可以结合铁和氧气的血红素.
Normal hemoglobins, contain alpha, beta, delta, and gamma globin chains.
HbA HbS
Gg
Homozygote
Ag
d
b
SS
C型血红蛋白分子病
变异体位置:AA 6: GAG (谷氨酸) AAG (Lys)
Chromosomes 16

N HbC
b
AC
HbA
Chromosomes 11
Gg Ag d
Heterozygote AC
SC
Gg Gg
Ag Ag


Capillarys Minicap 血红蛋白条带识别表
Capillarys/Minicap区带识别表
Z 15 : Hb H Z 14 : // Z 13 : Hb-J Rovigo, Hb N-Baltimore, J-Kaoshiung Z 12 : Hb Bart’s, Hb Providence, Hb J-Mexico, Hb J-Baltimore…. Z 11 : Hb Kaoshiung(New York),denaturated Hb A Z 10 : Hb Hope, Hb M-Iwate Z 9 : Hb A, Hb Camperdown, Hb Phnom Penh…… Z 8 : Acetylated Hb F, Hb Altanta, Hb Athens-GA Z 7 : Hb F, denaturated Hb S, Hb Porto-Allegre…….. Z 6 : Hb D-Punjab, Hb Philadelphia, Hb Korle-Bu, Hb Lepore, Hb Kö ln,denaturated Hb E…. Z 5 : Hb S, Hb Hasharon, Hb Handsworth, denaturated Hb O-Arab. Z 4 : Hb E, denaturated Hb C, Hb Kö ln, Hb A2 variants, M-Iwate Hb A2 variants Z 3 : Hb A2, Hb O-Arab Z 2 : Hb C, Hb Constant Spring, Setif HbA2 variant Z 1 : Hb dA2 Hb A2, Hasharon Hb A2 variant, Winnipeg Hb A2 variant……


Capillarys :
- 检测速度: 40 样品/小时 - 试管架1 至 7号位放置样品, 8号位放 4ml溶血素

Minicap :
- 检测速度: 10 样品/小时 - 试管架1 至 26号位放置样品, 27号位放溶血素(8个样品 消耗5ml溶血素)
Capillarys/Minicap血红蛋白检测标本要求
血红蛋白检测的几种方法

目前, 血红蛋白检测步骤如下: - 电泳法对Hb进行检测 或者使用等电聚焦电泳法
- 使用 HPLC法进行确认.
凝胶电泳结果识别表
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等电聚焦电泳法

在pH梯度的凝胶片上, 根据 蛋白不同的等电点,对蛋白进 行分离 Hb电泳位置取决于缓冲液PH 值 蛋白电泳至其等电点位置后, 停止泳动
镰刀型红细胞血症
变异体出现在 6 GAG (谷氨酸) GTG (缬氨酸)
normal gene abnormal gene
Chromosomes 16

N
N
SS
AS


HbS
b
Chromosomes 11
Gg Ag d
AS
Gg Gg Ag Ag d d b b
N
Hé Heterozygote té rozygote
其他特征 出生时少量 的 (~2%) Hb Bart’s 出身时Hb Bart’s (~5%)
Hb H 0
Hb A2 正常
Hb F 正常
贫血 0
小红细胞 0
靶细胞 0
异常
一条链缺失
0
正常或减 少
正常
0
0
0
2条链缺失
不稳定血红 蛋白溶血性 贫血 (Hb H)
胎儿水肿综 合症 (hydrops fetalis)
全自动毛细管电泳法进行血红蛋白检测 Capillarys 2 / Minicap
Capillarys 2
Minicap
毛细管电泳法原理
Peltier温控桥
电泳 检测器 氘光灯
高电压
Cathode -
Anode +
DETECTION
负电极 -
INJECTION
正电极 +
EOF Electro migration
Leabharlann Baidu
10-15%
减少
也许增加
轻微的到 严重的
+
+
3条链缺失
0
0
100 % Hb Bart’s
严重的
-
-
4条链缺失
基因型
诊断
血常规
临床症状
检测结果
/
-/ -Thalassaemia 2 轻微小红细胞症 MCV : 75-80fL 杂合体(静止型) MCH: 20-24 -Thalassaemia 2 纯合体 -Thalassaemia 1 杂合体 HbH 小红细胞症 血红蛋白减少 Hb: 11-12 g/dL MCV: 65-75 MCH: 20-24 小红细胞症 血红蛋白减少 Hb: 8-11 g/dL MCV : 55-65 MCH: 20-24 严重贫血 水肿胎 Hb: 8-11 g/dL MCV 100-110 MCH
需要分析序列分析或 DNA 序列分析 HbA2 N or Hb Bart’s < 5% Hb H 10-20%
出现溶血 脾脏肿大
- -/- -
-Thalassaemia 1 纯合体(死胎)
无法存活 死胎
Absence of HbA and HbF Hb Bart’s 80-100% Hb Portland < 5%
3
三维结构

4 亚单位
2 alpha链 ○ 2 alpha genes 3 «非 »alpha链 : beta, delta, gamma ○ 1 b gene , 1 d gene , 2 g genes
Chromosomes 16 Chromosomes 11
Gg Gg



目前, 已经证实的有超过1000 种以上的变异体(, b, g and d) 大部分变异体出现频率较低, 并且没有明显临床症状 4种主要变异体 (Hb S, Hb C, Hb E and Hb DPunjab)出 现频率较高 ( 特定人群) ○ 携带者会出现健康问题 ○ 儿童可能在出生时即伴随有严重症状
Alpha 地中海贫血
o
常见区域
常见与远东地区,非洲和地中海区国家 o 临床症状: 根据Alpha基因的表达状态, 有4个不同程度的Alpha地贫症状 * 1 个基因表达沉默: 静止型 (非常难检测到, 在出生会测到Hb Bart’s 1-2% ) * 2 个基因表达沉默: 轻型alpha地贫,在出生会测到Bart’s 2-10% * 3 个基因表达沉默: 血红蛋白Hb H病, 出生时出现2-30% Bart’s, 儿童-成人出现 10-15% Hb H * 4 个基因表达沉默: Hb Bart’s胎儿水肿综合征 (死胎)
d
Ag Ag
b
d
b
HbA b HbF g HbA2 d
100
%
正常结果
90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 0 12 24 36 Age (months)
Hb F
+
Hb A: b
Hb F: g Hb A2:d
成人
琼脂糖凝胶 Hydrasys® (Sebia) 碱性缓冲液
蛋白电泳
带正电荷的缓冲液 此时,电渗力(EOF)远远强于电场力.
毛细管壁负离子鞘 因此,蛋白被动从正极向负极端移动.
Capillarys/Minicap血红蛋白电泳
血红蛋白条带,在电渗力的作用下,8分钟即完成电泳过程, 然后,在415nm紫外光下被检测并显示出来. 正常质控品 必须在每天检测前使用