第三章-基因组文库的构建讲解学习
cDNA和基因组文库DNA的构建
结构 环状
线状 环状
E.coli E.coli E.coli 酵母细胞
环状 环状 环状 线性染色体
哺乳动物细胞 动物细胞
环状 环状
动物细胞和细 菌
环状
插入片段 很小,<8kb
9-24kb <10kb
35-45kb 约300kb 100-800kb
1002000kb >1000kb
举例 pUC18/19 ,某种生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体；cDNA是指含有所有重组cDNA的克隆群体.
基因组：来源于基因组DNA,反映基因组的全部信息,用 于基因组物理图谱的构建,基因组序列分析,基因在染色体上的定位, 基因组中DNA (互补DNA）
第二条DNA链
1：反转录酶催化合成cDNA第一链
• 1 . 1.在置于冰上的无菌微量离心管内混合下列试剂进行cDNA第一链的合成： poly(A) RNA (1μg/μl) 10μl 寡核苷酸引物(1μg/μl) 1μl 1mol/L Tris-HCl (pH8.0, 37℃) 2.5μl 1mol/L KCl 3.5μl 250 mmol/L MgCl2 2μl dNTP溶液（含4种dNTP,每种5mmol/L） 10μl 0.1 mol/L DTT 2μl RNase抑制剂（选用） 25单位 加H2O至 48μl 1 . 2.当所有反应组在0℃混合后,取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml微量离心管内. 在这个小规模反应管中加入0.1μl α-32P dCTP（400 Ci/mmol, 10mCi/ml）.
4：接头或衔接子的连接
cDNA末端的削平 4.1.cDNA样品于68℃加热5 min. 4.2.将cDNA溶液冷却至37℃并加入下列试剂： 5×T4噬菌体DNA聚合酶修复缓冲液 10μl dNTP溶液,每种5 mmol/L 5μl 加H2O至 50μl 4.3.加入1~2单位T4噬菌体DNA聚合酶（500单位/ml）,37℃温育 15min. 4.4.加入1μl 0.5mol/L ED . 5.在所有四小份样品（来自步骤2和步骤4）加入 100 ng质粒DNA或500 ng的λ噬菌体DNA.这些未甲基化 的DNA在预实验中用作底物以测定甲基化效率. 3 . 6.所有四份小样实验反应和大体积的反应均在37℃ 温育1h. 3 . 7.于68℃加热15min,用酚：氯仿抽提大体积反应液 一次,再用氯仿抽提一次. 3 . 8.在大体积反应液中加入0.1倍体积的3 mol/L乙酸钠 （pH5.2）和2倍体积的乙醇,混匀后贮存于-20℃直至获 得小样反应结果.
基因文库的构建
为了最大限度保证度的断裂。制备的
DNA分子规方法制备的染色体 DNA的长度一般在100 kb左右 如果先将细胞固定在低融点凝 构建流程
随机引物引导的 cDNA 合成是采用 6－10 个随机 碱基的寡核苷酸短片段来锚定 mRNA 并作为反转录的 起点。 由于随机引物可能在一条 mRNA 链上有多个结合 位点而从多个位点同时发生反转录，比较容易合成特 长的 mRNA 分子的 5‘端序列。 随机引物 cDNA 合成的方法不适合构建 cDNA 文 库，一般用于克隆特定 mRNA 的 5' 末端，如 RTPCR 和物体中，不同组织和细胞在不同时段的mRNA
种类不同（即基因
① 细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离； ② 第一链 cDNA 合成； ③ 第二链 cDNA 合成； ④ 双链 cDNA 克隆
Total RNA的提取 mRNA的分离 cDNA双链的合成 载体的制备 cDNA双链和载体的连接 转化或转染 快速鉴定 pBlueScript cDNA库扩增
5’
AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’ T4-DNA ligase AAAAAAAAAAAAAAOH 3’ TTTTTTTTTTTTTTp 5’
5’ 3’
cDNA第二链的合成
引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5’端序列
G 5‘ppp’5 G
AAAAAOH 3’ TTTTTp 5’ TdT dCTP AAAAACCCCCCCOH 3’ TTTTTp 5’ NaOH TTTTTp 5’
A A A A
白酶K、RNaseA的缓冲液中浸泡，可获得 >100 kb大小的DNA片段基因的构建程序③基因组DNA的切割
第三章 cDNA文库和基因组文库
片段
• 缺点： 酶切可能切断cDNA
对策：
利用切点稀少的限制酶
甲基化
• 接头（adapter）
是一类人工合成的一头具有某种限制酶粘性末端，
另一头为平末端的特殊的寡核苷酸片段。
• 可能问题：
接头自身连接
• 解决方法：
接头分子一端磷酸化
具异常的5’-OH粘性末端结构的Bam稀少的限制酶
②dG：dC段可能影响转录和测序
back
同聚物加尾法克隆双链cDNA
通过依次加入、连接 合成的DNA衔接物 进行cDNA克隆
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
• 衔接物（linker）
指用化学方法合成的一段由10-12个核苷酸组成，具
有一个或数个限制酶识别为点的5% 15000种
• 步骤： ①新鲜材料 ②提取RNA（mRNA） ③第一条cDNA链的合成
反转录酶④第二条cFra bibliotekNA链的合成⑤双链cDNA同载体的连接
置换合成/引物-衔接头法
λgt10/ λgt11
利用oligo（dT）引物和反转录酶合成cDNA第一链
自身引导法合成双链cDNA
双链cDNA的置换合成
引物-衔接头法合成双链cDNA
• 双链cDNA的置换合成缺点：
缺少对应于mRNA5’端的几个核苷酸
• 引物-衔接头法优点： ①利于获得全长cDNA ②利于和载体连接 缺点： ①酶切可能切断cDNA
• 部分酶解片段越大，所需重组体数目越少 • 载体：λ噬菌体 细抑制自身连接 ②基因组DNA不互补，稍短的片段极不可能连接成 带有原基因组上非相邻DNA区段的结构
第3章 基因工程-【必背知识】高二生物章节知识清单(人教版选择性必修3)(教师版)
新人教版生物学选择性必修3《生物技术与工程》知识梳理第三章基因工程第一节重组DNA技术的基本工具基因工程：指按照人们的愿望，通过转基因等技术，赋予生物新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物制品。
从技术操作层面看，由于基因工程是在DNA分子水平上进行设计和施工的，因此又叫重组DNA技术。
一、分子手术刀—限制性内切核酸酶1.全称和简称全称：_限制性内切核酸酶_简称：__限制酶_2.来源：主要是从_原核生物__中分离纯化出来的3.作用：①能够识别_双链_DNA分子的某种_特定核苷酸序列。
①使_每一条_链中_特定部位_的_磷酸二酯键__断开。
4.作用部位：_磷酸二酯键__5.识别序列：大多数限制酶的识别序列由_6_个核苷酸组成，也有少数限制酶的识别序列由_4_个、_8_个或__其他数量_的核苷酸组成。
6.切割结果：DNA分子经限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式__黏性末端_和__平末端__。
(1)EcoR①限制酶切割EcoR①识别序列为GAATTCEcoR①切割部位为GA之间的磷酸二酯键(2)Sma①限制酶切割Sma①识别序列为CCCGGGSma①切割部位为CG之间的磷酸二酯键二、分子缝合针—DNA连接酶1.功能：将__两个DNA片段连接起来_，恢复被限制酶切开的_磷酸二酯键__。
2.种类E·coli DNA连接酶T4DNA连接酶来源大肠杆菌T4噬菌体特点只缝合黏性末端缝合黏性末端平末端作用恢复被限制酶切开的两个核苷酸之间的磷酸二酯键3．比较与名称作用部位作用底物作用结果限制酶磷酸二酯键DNA将DNA切成两个片段DNA连接酶磷酸二酯键DNA片段将两个DNA片段连接为一个DNA分子DNA聚合酶或热稳定DNA聚合酶磷酸二酯键脱氧核苷酸将单个脱氧核苷酸依次连接到单链末端DNA(水解)酶磷酸二酯键DNA将DNA片段水解为单个脱氧核苷酸解旋酶碱基对之间的氢键DNA将双链DNA分子局部解旋为单链，形成两条长链RNA聚合酶磷酸二酯键核糖核苷酸将单个核糖核苷酸依次连接到单链末端三、分子运输车——载体1.作用：携带外源DNA片段进入受体细胞。
基因组文库构建流程
桑植旅游宣传语征集桑植是湖南省张家界市的一个县级市，是一个具有悠久历史和丰富自然景观的古城。
桑植的山水和文化历史资源极其丰富，是一个适合旅游的好地方。
在这里我们征集桑植旅游宣传语，一起来看看吧。
1、桑植，历史文化名城，风景宜人之地。
2、桑植，张家界市的明珠，为您呈现一场梦幻之旅。
3、桑植，融山水田园之美，温情热情陪您玩转之旅。
4、桑植，一颗湘西夜明珠，灵动之旅。
5、桑植，红色旅游圣地，感受革命先烈肝胆披沥的那份英雄气概。
6、桑植，绿水长流，刻印着青山绿水的美好与宜居。
7、桑植山水妙，文化源远它。
8、桑植，国内定西班牙，欢快的歌声浪漫的舞蹈，营造出无穷的浪漫气息。
9、桑植，感受祖国的大好河山。
10、桑植，让你心驰神往，回味无穷的旅游圣地。
11、桑植，经典旅游区，为您梦幻之旅加持。
12、桑植，红色文化之都，一路向前的勇气，黄土高原上那朵不灭的火焰。
13、桑植，红色美景，带您感受红色文化之旅。
14、桑植，美丽乡村，闲情逸致之旅。
15、桑植，湘西风情之旅，领略湘西文化的魅力。
16、桑植，浪漫之旅，带给您和伴侣一个难忘的体验。
17、桑植，感受红色之魂，领略革命先烈的英勇事迹。
18、桑植，世外桃源，放松心情的好地方。
19、桑植，与自然互动，感受大自然的魅力。
20、桑植，色彩斑斓的文化之旅，带给您独一无二的视觉体验。
21、桑植，品味触摸历史的精髓，一场非凡的之旅。
22、桑植，自然与人文的交融，给您带来无限的惊喜和收获。
23、桑植，高山流水之家，开启您的山水文化之旅。
24、桑植，万象素妍之美，探寻桑植的秘密之旅。
25、桑植，看山看水看美丽，看人看文化看艺术之旅。
总之，桑植是一个非常适合旅游的好地方，无论是自然景观还是文化历史，都非常的丰富，是一个旅游胜地。
我们希望通过这些宣传语，向大家展示桑植的美丽和魅力，吸引更多的旅游者前来。
第三章基因工程目的基因的获取分离
用氢氧化钠消化杂合双链 中的 mRNA 链
解离的第一链 cDNA 的 3‘末端就会形成一个发夹环 （发夹环的产生是第一链 cDNA 合成时的特性，原因 至今未知，据推测可能是 由帽子的特殊结构相关）
引导 DNA 聚合酶复制出第 二链，此时形成的双链之 间是连接在一起的
再利用 S1 核酸酶将连接处 （仅该位点处为单链结构） 切断形成平通过几种限制性内切酶切
割，所产生的基因组DNA片段与载体重组并克 隆，由此产N=ln（1DNA片段的出现概率。 f：是插入片段的大小与全基因组大小的比值。
第一：细胞总 RNA 的提取和 mRNA 分离；
mRNA
总RNA
tRNA 第二：第一链 cDNA 合成；
rRNA 第三：第二链 cDNA 合成；
2 合成cDNA第一条链 第四：双链 cDNA 克隆进质粒或噬菌体载体
（1）随机引物引导法
并导入宿主中繁殖。
（2）oligo（dT）引导法
（1）随机引物引导法 5´
链 cDNA 为模板合成一段段互补的序列。同时，大肠杆菌 DNA 聚合酶 Ⅰ 的 3'--5'
cDNA 片段。这些 cDNA 片段进而核酸外切酶的活性可将暴露出的第一链 cDNA 的
在 DNA 连接酶的作用下连接成一 3'-端部分消化掉，形成平端或差不多的平端。这
条链，即 cDNA 的第二链
种方法合成的 cDNA 在 5'-端存在几个核苷酸缺失， 但一般不影响编码区的完整。
查阅资料自学！
如何找回两膜或硝酸 纤维素滤膜之后，就可以同特异性
的核酸探针进行菌落或噬菌班杂交，
A 应用核酸探针分离克隆的目的基因 以便筛选出具有目的基因的阳性克 隆。这个过程叫做克隆基因的分离
基因组文库的构建过程
基因组文库的构建过程1. 基因组文库到底是什么？说到基因组文库，很多人可能会一脸懵，觉得这跟他们平常的生活完全扯不上关系，其实这就是科学家们用来储存基因信息的一种方式。
简单点说，就是把所有的基因像书一样整理好，方便后人查阅、研究和利用。
好比我们会把一本厚厚的食谱分门别类，想吃什么菜随时翻出来，这就是基因组文库的妙处。
在它的庇护下，科研人员就能随时拿出各种基因的“身份证”，让小小的基因发挥出超大能量。
2. 构建基因组文库的步骤2.1 提取DNA首先，咱们得从细胞中提取出DNA，这可是整件事情的开端。
就像从果子里挤出果汁，如果不先把果子准备好，你再想喝到果汁，简直是白日做梦。
提取DNA的过程看似简单，但可得小心谨慎，免得“失之毫厘，谬以千里”。
科学家们用各种化学试剂，像是一场小型的化学派对，最终把DNA提取出来，然后像捡到宝一样，小心呵护着。
2.2 进行切割提取完DNA后，接下来就是切割了！没错，听起来有点儿暴力，但这其实是为了让DNA变得更小，方便我们后面进行分析。
科学家们用一种特别的酶，就像料理大厨用刀切菜一样精准，可以把DNA切割成许多小片段。
每一片都是独特的，有点像拼图的每一块，只等着我们组合拼接。
2.3 建库接下来说到建库，小伙伴们要聚焦了！这一步可是整件事的重头戏。
科学家们会把这些切割好的DNA片段拷贝到一种载体中，类似把拼图放进一个大盒子里，当然这个“盒子”可是经过特殊设计，能确保我们的DNA安全无虞。
这个过程就叫做克隆，听起来是不是有点科幻感？别担心，脑子里别想太多电影情节，这可是正儿八经的科学探索。
3. 筛选和验证3.1 筛选目标片段库建完后，接下来就进入了筛选阶段。
就像我们去超市挑水果，总得挑一些看起来新鲜的，基因组文库也是如此。
一些基因有可能因为各种原因不太好，科学家们会通过培养和筛选，把一些很有潜力的基因片段挑出来。
这其中的细致和耐心，简直堪比工匠精神，得一丝不苟。
3.2 验证质量最后一步是验证，就像做一道菜，你不能光有调料，还得保证味道正宗。
怎样构建基因组文库
i. 两菌株分别培养,分别收集和制备，包装前混合---本底低（对λDNA分子大小有严格限制），高效。
ii. 两菌株分别培养，混合收集和制备----操作简单， 本底高，可包装不同大小的λDNA分子。
2） 重组λDNA分子的包装过程 包装制备物（-70℃）于冰上缓慢融化 加入重组 λDNA分子 边融化边混合边包装 离心除去 细胞碎片 λ颗粒于-70℃保存待用
sa c B
K anr
p a c lo x P
D N A h ea d fu l
+
+ p a c c le a v a g e
p r o te in
C re
R e c o m b ila tio n
DNA
A m p lific a tio n七. 利用YAC载体构建基因组1. 两臂DNA片段的制备:
第四章基因的建立来自基因文全部遗传信息的重组D因组DNA长度之比
S
C o s o r i A pr S
SalI Cos
S
H
S
S1 Cos
H
BamH I 小片段
Cos
H
35-45kb DNA 片 段
T4 DNA ligase
Cos
H
利
构用
建双
COS
基
因
组质
文粒
S
离体包装
S
库载
感 染 E.coli
体六. 利用P1载体构建基因组构建过程也与λ载体构建过程十分相似:
1. 两臂DNA片段的制备: pAD10sacB BamHI/ScaI 2. 供体DNA片段的制备: 部分酶切 蔗糖梯度离心 3. 两DNA的连接和重组DAN分子的包装
第3章第1节第2课时基因工程的基本操作程序课件--苏教版2019 高中生物选择性必修3
(2)从RNA方面检测受体细胞 ①方法：分子杂交技术。 ②操作：从待测转基因生物细胞中提取mRNA分子，用已标记 的目的基因片段 作为探针与mRNA杂交，观察是否出现杂交带。
(3)从蛋白质方面进行检测 ①方法：抗原—抗体杂交 。 ②操作：从待测转基因生物中提取蛋白质，再用相应的抗体进 行抗原—抗体杂交，观察是否出现 杂交带。 (4)从个体水平进行鉴定：检测转基因生物是否表现出目的基因 控制的性状。
③过程 将目的基因插到农杆菌Ti质粒的 TDNA 特定区段上→转入 农杆菌→侵染植物细胞→整合到受体细胞染色体的 DNA 上→目的 基因稳定的遗传和表达
(2)将目的基因导入动物细胞 ①主要方法：显微注射法。 ②操作对象： 受精卵。 ③其他方法：也可用 病毒DNA 与目的基因一起构建的载体， 去感染受体动物细胞。
限制酶 BamHⅠ
HindⅢ
EcoRⅠ
Sma Ⅰ
识别序
列及切
割位点
图2 图1
①构建基因表达载体时，能否用Sma Ⅰ酶切割质粒？为什么？
提示：不能；因为Sma Ⅰ会破坏质粒的抗性基因。质粒上的抗 性基因是标记基因，便于重组DNA分子的筛选，若被破坏，无法进 一步筛选。
②与只使用EcoRⅠ相比较，使用BamHⅠ和HindⅢ两种限制酶 同时处理质粒、外源DNA的优点是什么？
NO.1 必备知识·聚焦概念
一、基因工程的基本操作程序 1．目的基因的获取 (1)通过化学合成法直接人工合成目的基因 ①对于比较小的目的基因，在明确脱氧核苷酸序列后，可以通 过DNA合成仪直接人工合成。 ②全基因或较大基因，使用半合成 的生物体 全部基因片段 的重组DNA 的克隆群体。 特点：受体菌群中的不同个体含有该种生物的不同基因拷贝， 整个菌群所含有的基因拷贝便可能涵盖了该生物的所有基因 。 筛选方法：一般采用核酸探针杂交 的方法。
基因组文库构建的程序
基因组文库构建的程序1. 引言基因组文库构建是现代生物学研究中的重要步骤之一。
通过构建基因组文库，研究人员可以将生物体的基因组DNA进行分离、纯化和扩增，为后续的基因组测序和功能分析提供重要的材料。
本文将介绍一种常用的基因组文库构建程序，并探讨其在生物学研究中的应用和意义。
2. 基因组文库构建程序概述2.1 DNA提取在进行基因组文库构建之前，首先需要从生物体中提取DNA。
DNA提取方法可以根据不同生物体类型和样本来源进行选择，常见的方法包括酚/氯仿法、离心法、商用DNA提取试剂盒等。
2.2 DNA片段化DNA片段化是将长链DNA切割为较短片段的过程。
常用的片段化方法包括限制性内切酶切割、超声波处理、化学法等。
选择合适的片段化方法可以根据后续实验需求和测序平台要求来确定。
2.3 DNA末端修复和连接在片段化后，需要对DNA末端进行修复，并在修复后对连接适配体进行连接。
末端修复可以通过使用DNA聚合酶和DNA连接酶来完成。
连接适配体是一种含有特定序列的DNA片段，可以与测序平台上的引物配对，使得测序引物能够与待测DNA片段结合。
2.4 DNA片段扩增和纯化连接适配体后，需要对文库中的DNA片段进行扩增和纯化。
扩增方法通常使用聚合酶链式反应（PCR）进行，以获得足够数量的文库DNA。
纯化则是通过凝胶电泳、磁珠吸附等方法去除杂质和副产物，获得高质量的文库DNA。
2.5 文库验证和测序最后一步是对构建好的基因组文库进行验证和测序。
验证可以通过凝胶电泳、定量PCR等方法来确定构建文库中的DNA片段长度分布、纯度以及数量。
而测序则可以使用各种高通量测序平台进行，并根据实验目标选择合适的测序深度。
3. 基因组文库构建程序在生物学研究中的应用3.1 基因组结构分析基因组文库构建程序为研究基因组结构提供了重要工具。
通过对不同细胞类型或不同物种的基因组文库进行测序，可以揭示基因组的结构变异、拷贝数变异以及染色质重排等信息，为研究基因组结构与功能的关系提供重要线索。
基因文库的构建与使用
基因文库的构建与使用在生物科学领域，基因文库的构建和使用是研究基因功能和生物多样性的重要工具。
基因文库是指包含某种生物全部基因的克隆文库，它可以为我们提供深入了解该生物基因组的信息。
本文将详细介绍基因文库的构建与使用，包括基因文库的基本概念、构建方法、使用方法以及优势和展望。
一、基因文库的基本概念和作用基因文库是包含某种生物全部基因的克隆文库，它为我们提供了该生物基因组的全面信息。
构建基因文库的目的是为了方便研究者们筛选、分析和研究基因的功能以及多样性。
基因文库可以用于寻找基因的新颖功能、发现新的药物靶点以及为基因组编辑和改造提供资源。
二、构建基因文库的方法构建基因文库主要包括以下步骤：1、基因组文库的构建：首先需要获得该生物的基因组，然后将基因组进行分解，形成一系列重叠的DNA片段。
这些片段经过纯化、扩增和克隆到特定的载体中，形成基因组文库。
2、表达文库的构建：为了筛选出具有特定功能的基因，还需要构建表达文库。
表达文库中的基因需要在特定的细胞或组织中表达，以便研究者们能够确定基因的功能。
在构建基因文库时，需要考虑到基因的种类、基因表达水平以及克隆载体的选择等因素。
这些因素都会影响到基因文库的质量和实用性。
三、基因文库的使用方法使用基因文库可以方便地筛选和研究基因的功能。
以下是如何使用基因文库的一般步骤：1、选择相应的基因文库：首先需要选择包含所需基因的文库。
如果研究目标是寻找特定功能的基因，可以选择包含该功能基因的文库。
2、筛选候选基因：根据研究目标，可以在文库中进行筛查，挑选出可能具有所需功能的候选基因。
3、验证基因功能：通过实验验证挑选出的候选基因是否具有所需功能。
这可以通过表达和检测候选基因在细胞或整体生物中的功能来实现。
4、利用基因文库进行基因组编辑：基因文库也可以为基因组编辑提供资源和指导。
通过比对和分析基因文库中的序列，可以确定目标基因的精确位置和剪切位点，从而实现精准的基因组编辑。
第三章--基因与基因组的结构PPT课件
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③近20年来，由于重组DNA技术的完善和应 用，人们已经改变了从表型到基因型的传统 研究基因的途径，而能够直接从克隆目的基 因出发，研究基因的功能及其与表型之间的 关系，使基因的研究进入了反向生物学阶段。
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5
• 反向生物学：指利用重组DNA技术和离体 定向诱变的方法研究已知结构的基因相应的 功能，在体外使基因突变，再导入体内，检 测突变的遗传效应即表型的过程。
• 例如，对于大肠杆菌和其他细菌，用三个小写
字母表示一个操纵子，接着的大写字母表示不
同基因座，lac 操纵子的基因座：lacZ，lacY， lacA；其表达产物蛋白质则是lacZ，lacY，
lacA。
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37
• 3．质粒和其他染色体外成分的命名 • 自然产生的质粒，用三个正体字母表示，第—
个字母大写，例如：ColEⅠ；
血破裂而使血红蛋白计数减少，造成贫血。
• 其本质是其血红蛋白的β-链与正常野生型
β-链之间的第6位氨基酸，由Val取代了 Glu所致。
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• 这种贫血病是由基因突变造成的一种分子病，
除溶血后发生贫血外，还会堵塞血管形成栓塞， 从而伤及多种器官。
• 它的纯合子(通过单倍体形成的纯系双倍体)患
者在童年就夭折。
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• 6．线虫基因的命名
• 用三个小写斜体字母表示突变表型，如存
在不止一个基因座，则在连字符后用数字
表示，如基因unc-86，ced-9；蛋白UNC-
86；CED-9。
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• 7．植物基因的命名
• 多数用1～3个小写英文斜体字母表示。
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• 8．脊椎动物基因的命名
基因文库构建的过程、原理及方法
基因⽂库构建的过程、原理及⽅法基因⽂库构建的过程、原理及⽅法1 cDNA ⽂库的构建1.1 cDNA ⽂库构建的基本原理与⽅法cDNA ⽂库是指某⽣物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA ⽚段与某种载体连接⽽形成的克隆的集合。
经典 cDNA ⽂库构建的基本原理是⽤ Oligo(dT) 作逆转录引物，或者⽤随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得⽂库。
其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取⽅法的选择主要根据不同的样品⽽定)，要构建⼀个⾼质量的 cDNA ⽂库，获得⾼质量的 mRNA 是⾄关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细⼩⼼。
由于RNA 酶存在所有的⽣物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建⽴⼀个⽆ RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。
在获得⾼质量的 mRNA 后，⽤反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第1链， cDNA 第2链的合成(⽤ RNA 酶 H 和⼤肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使⽤ T4 噬菌体多核苷酸酶和⼤肠杆菌 DNA 连接酶进⾏的修复反应)，合成接头的加⼊、将双链DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插⼊⽚断，扩增 cDNA ⽂库、对建⽴的 cDNA ⽂库进⾏鉴定。
这⾥强调的是对载体的选择，常规⽤的是λ噬菌体，这是因为λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可⽤来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳⼤⽚段的外源 DNA。
1.2 cDNA 全长⽂库经典 cDNA ⽂库的构建虽然⾼效、简便，但⽂库克隆的⽚段⼀般较⼩，单个克隆上的 DNA⽚段太短，所能提供的基因信息很少，⼤多需要⼏个克隆才能覆盖⼀个完整的全基因的 cDNA。
为了克隆到真正的 cDNA 全长，建⽴富含全长的 cDNA⽂库具有重要意义。
为此，必须克服仅⽤ mRNA 的 PolyA 尾合成以及由普通逆转录酶作⽤特点所导致的局限性。
基因组文库的构建培训讲学
3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基 中
方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为25% 的甘油，于-70 oC或-25 oC下保存。
缺点：需保存的列合成引物， 扩增特异性片段
结束语
谢谢大家聆听！！！
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• 对于高等真核生物而言，基因组DNA十 分庞大,基因可达数万个，且基因组成结 构复杂，除编码序列，还有非编码序列 及调控序列，基因间还存在大量的间隔 序列和重复序列，因此，单个目的基因 在整个基因组中所占的比例极其微小， 除少数例外，绝大多数基因难以克隆子的保存与筛选1、基因组DNA的保存1) 影印膜滤保存法
2）在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培加的序列过多或过少。
（一）生物基因组DNA的提取 染色体DNA
（二）基因组DNA的不完全酶切
1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/1024
2、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因：< 10 kb b) 克隆基因族：< 20kb
①载体DNA的制备； ②高纯度大相对分子质量基因组DNA的
提取和大片段的制备； ③高纯度大相对分子质量基因组DNA的
部分酶切与脉冲电泳分级分离； ④载体与外源片段的连接与转化或侵染
宿主细胞； ⑤重
基因重组
体外包装
转化细菌四、生物基因组DNA的构建一个理想的基因组DNA应具备下列条件： • 重组克隆的总数不宜过大，以减轻筛选工作的压力 • 载体的装载量最好大于基因的长度，避免基因被分隔克隆 • 克隆与克隆之间必须存在足够长度的重叠区域，以利克隆
基因文库的构建
（2）cDNA与载体相连
cDNA与一个载体在T4连接酶作用下以粘末端 互相连接，即为重组DNA 分子。
（3）导入宿主细胞 重组体在一定条件下导入宿主细胞培
养或保存。 宿主细胞必须是来自一个细胞的克隆
体的寡核苷酸链为探针）
2. mRNA比基因组中基因少, 因此筛选某一特 定功能基因工作量较小。
3. mRNA中拷贝数大于基因组中的拷贝数, 利 于获得较多的模板。（转录特征）
4. 可在原核细胞中表达有生物活性蛋白
5. 不同种类不同状态的细胞的cDNA不同 6. 不能研究基因组的结构功能
构建cDNA1.制备mRNA凝胶阻滞法
DNase Ⅰ足迹法
4.7.1 凝胶阻滞实验
又叫DNA迁移率变动实验（DNA mobility shift assay），是在80年代初期出现的用于 在体外研究DNA与蛋白质相互作用的一种特殊 的凝胶电泳技术。它具有简单、快捷等优点， 也是当前被选作分离纯化特定DNA结合蛋白质定长度的DNA片段克隆到某种载体上发育时期所转录的mRNA 经逆转录形成的cDNA片段与某种载体ene pool)：某一生物群体所拥有的全部基因。
4. 筛选目的基因
原核细胞不可用来作为基因的表达系统 （无转录后加工）。
原核细胞基因库——只能用核酸探针杂 交筛选目反转录酶的作 用下将点：
1. cDNA无内含子, 长度较基因组基因小, 使操皿内所形成的菌落或噬菌斑）转印到硝酸 纤维素膜上，碱解后加带标记的探针进行杂交，能显 示特异结合探针的点（克隆）便是目的基因所在处。 确定菌落或噬菌斑的位置，扩增，提取，再用限制性 酶切出cDNA基因片断，即为目的基因。（如图）
溶菌、使DNA 暴露
第三章基因文库的构建
频率和6Kb
★
G
Chemically synthesized
oligonucleotide
★
Anneal
TCAGGCT
T
★
Wild-type
(1) (1) DNA polymerase + 4 dNTPs
(2) T4 DNA ligase + ATP
正链DNA的合成
按照体外
DNA重组技术,将待突变的DNA片
G
段插入到M13噬菌体上. 然后制备
平末端 连接
加接头造成 粘性末端
细菌转化
重组噬菌体 DNA转染
重组质粒 的转化
体外包装 进行转导
重组体 的鉴定
表型鉴定
核酸杂交
免疫学分析
酶切A，把 所得到的大量基因组DNA片段与载体连接， 然后转化到细胞中去，让宿主菌长成克隆。 是某个生物体全部基因的随机片段的重组 DNA克隆群体。
SI核酸酶处理 Klenow 酶， 连接酶处理
16
一、缺失诱变 2、通过酶切图谱完成中间缺失
17
第三节：克隆DNA序列的体外诱变
二、盒式突变 1、原理：利用一段人工合成的具有突变序
列的寡核苷酸片段,取代野生型基因中的 相应序列。 2、人工合成的突变序列的特征
由两条合成的寡核苷酸组成的,当它们退火时,会按 设计要求产生出克隆需要的粘性末端, 由于不存在 异源双链的中间体,因此重组质粒全部是突变体。
(1) Screen plaques with 32P-labelled oligonucleotide as hybridization probe; (2) Isolate mutant
基因组DNA-文库的构建
工
具
限制性内切酶Sau3A、BamHⅠ； 准
备
琼脂糖凝胶（或蔗糖）；
T4连接酶；
注1：Sau3A与BamHⅠ，是一对同尾酶。 注2：同尾酶是指切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
泳分级分 的提取
离
cos L B S
S B R cos T4连接酶
约20kbDN片段 体外包装
重组噬菌体
侵染大肠杆菌大肠杆菌基因⑤ 体 外 包 装 与 转 化
➢5.
小
➢1.DNA
➢2.
➢3.
➢4.
结
如
基
基
为
何
因
因
什
制
组
组
么
文
DNA
DNA
作
要
库
一
构
与
cDNA
个
文
文
建
DNA
库
库
的
的
文
特
作
文
文
库
点
coscosbamh载体dnacos可用载体dna片段弃去中间片段真核基因组dna约310bpsau3a做局部消化被限制酶切开的dna片段琼脂糖凝胶电泳纯化约20kb片段cost4连接酶约20kbdn片段体1/12
BamH Ⅰ位点
cos L
R cos
载体DNA
弃去中间片段
cos L B B R cos
可用载体DNA片段
② 载 体 的 制 备
④③
HMW DNA
真核基因组DNA （约3×109bp）
脉
Sau3 A做局部消化
冲 电
基因文库的构建
N = ln (1 - 0.99) / ln (1 - [106bp / 3 x 109 bp]) = -4.61 / -3.33 x 10-6 = 138,298
表1各种载体的比较
载体
容量（kb）
宿主
导入细胞方式
黏粒
30-45
大肠杆菌
转导
P1
70-100
大肠杆菌
转导
PAC
130-150
大肠杆菌
电转
BAC
120滤膜影印杂交来筛选，但是这种方法对于构建区域阵列保存，既可以用传统的单拷贝的探针杂交法筛选，又可以用PCR进行多随机剪切DNA;接着用末端修复酶修复DNA，可以提高DNA连接入载体的效率;然后通过脉冲场电泳或者普通电泳来找到40kb左右的dna片段，随后使用Epicentre GELase胶回收试剂盒回(常用EcoR I、BamH I或者Hind III)来消化基因组DNA，然后通过脉冲场电泳找到合适长度的DNA片段(比如100kb-150kb)，随后透析回收DNA。
3.载体拷贝数的考虑
当把大片段DNA片段克隆到高拷贝的载体时，克隆DNA会发生重组，从而影响克隆序列的保真性和稳定性;而单拷贝载体的低产量DNA是高通量分析的瓶颈。这个矛盾常常困扰着研究者。
而EPICENTRE’s CopyControlTM克隆系统是对这些困难的最好的解决方案。CopyControlTM技术整合了单拷贝载体与多拷贝载体的优点。单拷贝载体能提高插入片段的稳定性，而且拷贝载体能在诱导剂的作用下，即时扩增出高拷贝数的克隆而获得高产量的DNA。
四、将基因组DNA片段连接入载体
第三章基因组文库的构建
体外包装
重组λ噬菌体载体的体外包装有两种不同的策略。一是利 用与编码包装蛋白的基因的突变体。野生型噬菌体的的包
装需要E、D、A等基因的产物，这些基因中的任何一个发
生突变噬菌体都不能顺利包装，从而在宿主的细胞中积累 了大量的前头部蛋白。BHB2688和 BHB2690两种菌株正是这
两种突变菌株，前者是E的突变体，后者是D 基因的突变体。
细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限制性酶剪切
尼龙膜 与放射性探针 进行分子杂交
膜
重组噬菌体
重组体DNA
细菌 感染
裂解
释放噬菌体菌苔 噬菌体克隆噬菌斑中的 噬菌体克隆用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主重 组cDNA的集合，通常是在细菌或酵母中。 这些克隆代表从某个特定物种或器官的所 有mRNA制备得到的cDNA。
序列污染； 2.尽可能用“ 电话克隆”。
第一节 DNA克隆片段的产生与分离
一.基因组DNA的片段化
1.用限制酶片段化:
用限制酶消化DNA，不经凝胶电泳分部分离,直接和载 体连接的克隆方法叫鸟枪法(shot-gan approach)
存在的问题：
① 所形成的重组体分子是一群带有大小不同插入片段 的混合群体。以每个载体可插入1～3kbDNA计算，
将硝酸纤维膜 铺在平板上
用针在膜 上作标记
取下膜,编号
将母板保 取下膜,编号 存在4℃
按胶上孔的位 置,在膜上扎孔
将第二 张膜铺 在平板 上
Plaque lift hybridzations are used to screen aλ library using radioactive DNA probes.
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用重组噬菌体感染适合的宿主菌，产生噬菌斑。每 一个噬菌斑来自单个感染噬菌体的一个克隆。
各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
限制性
(a)
酶切位点
Alu散在元件
启动子 外显子探针1 启动子启动子
探针2
探针3
Clarke-) ln(1 I / G )
N：该序列 I ：待克隆DNA片段的长度，假定为20kb; G : 基因组DNA的总长度，如人类为3×109bp
带有此DNA的克隆可通过放射自显影而显现出来。 这样阳性克隆可从培养基中分离出来，再转接到新 鲜的宿主菌中，使目的因得到的片段， 再用相同的限制性酶剪切外源基因组DNA，将约 15kb的酶切片段随机地和噬菌体载体的两臂连接， 形成线性的重组的串联体。“n”是细胞中最稀有的mRNA的拷贝数；
“T ”为细胞中各种mRNA的总拷贝数。
如哺乳动物细胞中约含560,000个mRNA，若分 析的基因在细胞中仅有8个拷贝，那么带入公 式，以99％的总RNA中，各种RNA丰 度不同。故Clarke-C少要含有5×105的个重组 体，可根据RNA的复杂性估计的计算方法和经 验来确定。其计算公式是：
N ln1( p) ln1( n/T)
细胞 基因组 用限制性 酶剪切
用连接酶 连接
λ噬菌体 提取DNA 用限制性酶剪切
尼龙膜 与放射性探针 进行分子染
裂解
释放噬菌体菌苔 噬菌体克隆噬菌斑中的 噬菌体克隆用放射自显影 定位阳性克隆 膜
阳性克隆 感染新鲜 的宿主菌菌体，每一个噬菌斑 来自单个感染噬菌体的一个克隆。
限制性酶消解用来构建克隆DNA的物理图谱
用酶（KpnⅠ和 Hind Ⅲ）来剪切载体，构建一个 SalⅠ插入片段的不完全酶切图谱。
M1 2 3 4 5 6 7 8 M
M：标记泳道，
是含有已知不同长度
的DNA，用来衡量
样本DNA的分子大
小。 1：SalⅠ-KpnⅠ； 2：HindⅢ； 3：SalⅠ-HindⅢ； 4：KpnⅠ-HindⅢ； 5：EcoRⅠ； 6：SalⅠ- EcoRⅠ； 7： KpnⅠEcoRⅠ； 8：HindⅢ- EcoRⅠ第三章-基因组的构建噬菌体克隆的构建。
(a)将外源基因组的D菌体，每一个噬菌斑来自单个感染噬菌 体的一个克隆。各个克隆带有不同的细胞DNA片段。
(b) 噬菌斑被转移到尼龙膜上，而噬菌体的蛋白被溶 解，和重组体DNA分开，DNA吸附到膜上。再将此 膜与带有放射性同位素标记的探针进行分子杂交， 可以杂交的便是目的基因。
(b) 噬菌斑的模式被转移到尼龙膜上，而噬菌体 的蛋白被溶解，和重组体DNA分开，DNA吸附 到膜上。再将此膜与带有放射性同位素标记的 探针进行分子杂交，可以杂交的便是目的基因。
三、亚克隆
所谓亚克隆（sub-clone）就是对已经克隆的目 的DNA片段经限制性酶消解后再次重新克隆， 其目的在于对目的DNA进行进一步分析，或进 行“重编程”。 亚克隆的基本过程： ①制备目的DNA片段和载体； ②连接目的DNA片段和载体； ③重组载体转化到宿主中； ④筛选重组子。
(b) mRNA
mRNA
mRNA 5kb一个典型的基因组含带有重叠基因片段的多拷 贝克隆。
(a)用从原有的克隆DN得与上述片段部分重叠的DNA序列。
罕见的酶切位点和重复DNA序列(如Alu分散元件)可 作为界标，用来排列分离的基因组DNA克隆。
将DNA亚克隆到质粒载体中的通用策略
①根据已知的酶切图谱进行定向克隆
（directed cloning）；
②用常用的限制性酶交错剪切或平切进行
随机亚克隆。
这种策略也称为“鸟枪法（shot-gun）”，即将 完整的基因组或部分基因组的DNA用限制性酶 或机械的方法随是将小片段逐一测NA片段的复合位点。在图中表示已克隆的50kb的 基因组DNA中含有三个转录的基因。
克隆数的确定
建库的关键是如何产生足够数量的重组 larke 和 J.Carbon 建立了ClarkeC的指导意义。
将数据代入上式
N ln(1 0.99) ln(1 20kb/ 3Gb)
= 7×105
N的含义是克隆大小99 小片段，但酶的选 择和酶切反应条件的选择是取决于克隆 载体的类型