最全的液相色谱知识 整理要点

最全的液相色谱知识（包括原理，维护，基础操作，处理方法）

流动相

a、流动相对样品具有一定的溶解能力

b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应(特殊情况除外)。

c、流动相的黏度要尽量小

d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应

e、流动相沸点不要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。

f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。

1.流动相必须用HPLC级的试剂.

2.流动相过滤后要用超声波脱气.脱气后应该恢复到湿温后使用.

3.长时间不使用仪器,应该将柱子取下用堵头封好保存.

4.每次做完样品后应该用溶解样品的溶剂清洗进样器.

流动相对样品有适当的溶解度，但不与样品发生化学反应，也不与固定液互溶；

流动相的纯度要高（至少分析纯）、粘度要小，以免带进杂质和组分在流动相中扩散系数下降；流动相应与所用检测器相匹配，不应对组分检测产生干扰作用。

对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。

当选用最佳流速时，分析时间可能延长。

可采用改变流动相的洗涤强度的方法以缩短分析时间(如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量)。

流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。种被污染的溶剂如用于HPLC 系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。

磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。

一、为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性请按照以下注意事项操作：

1、防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是过滤，可采用Millipore滤膜（0.2um 或0.45um ）等滤器。泵的入口都应该连接砂滤棒（或片），输液泵的滤器应经常换。

2、流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其是停泵过夜或更长时间的情况下。如果将含有缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静止，就可能析出盐的微小晶体，些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。因此，必须泵入纯水充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合固定相，可以是甲醇或甲醇和水）。

3、泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相用完，否则空泵运转也磨损柱塞、密封环或缸体，最终产生漏液。

4、输液泵的工作压力不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生漏液。

5、流动相应该先脱气，以免在泵内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大喊大量气泡，泵就无法工作。

二、如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应的措施排除故障：

1、没有流动相流出，又无压力指示。原因可能是泵内有大量的气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大的流量（5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一50ml的注射器在泵出口处帮助抽出气体。另一个原因可能是密封环磨损，需更换。

2、压力的流量不稳。原因可能是气泡，需要排除，或者是单向阀内有异物，可以卸下单向阀，浸入丙酮内，进行超声清洗。有时有可能是砂滤棒内有气泡或被盐的微小晶体粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，卸下砂滤棒浸入流动相内，超声除气泡，或将砂滤棒（片）浸入稀酸（如4mol/L 硝酸）内迅速除去微生物或将盐溶解，再立即清洗。

3、压力过高的原因，是管路被堵塞，需要清除或清洗。压力降低的原因则可能是管路有泄漏。检查堵塞或泄漏时可以逐段进行。

2、新柱柱效低

柱外死体积大.样品在流动相中溶解不好，影响传质过程。-换连接管，重新连接色谱柱，降低

死体积。使用合适的流动相或使用流动相溶解样品。

5、新柱接到仪器上后，柱头漏液。

柱接头与仪器之间连接管的压环变形量不够。-用扳手顺时针方向拧紧1／4圈直到不漏液为止。

6、新柱接到仪器上后，启动仪器没有柱压降。

柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。-继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。

7、新柱接到仪器上后，检测器出口不断有小气泡出现。

柱放置时间过长柱内充装的液体己挥发干。-继续开泵，用流动相将柱内气体置换掉。

流动相脱气不彻底特别是MeOH／H20体系由于氢键作用很容易出现气泡。-配好流动相后一定要进行脱气处理。

8、新柱接到仪器上后柱压降不断增加，甚至超过仪器的耐压限。

柱入口滤片被固体颗粒堵塞(或被毒菌堵塞)。-更换或清洗柱入口滤片；用0．45μm过滤膜过滤流动相除去微小颗粒物。

3、旧色谱柱柱效低，分离不好，柱入口床层塌陷。

填料被流动相溶蚀而流失。-用同型填料填补柱效可部分恢复。对硅胶质填料，流动相PH值在2—7范围内，否则可能被溶蚀。

4、旧色谱柱柱效低分离不好，有时出现双峰。

入门填料被污染变质所致。-用强溶剂冲洗。刮除被污染的床层，用同型的填料填补柱效可部分恢复。污染严重，则废弃或重新填装。

9、[b]进样次数增加柱压降逐渐增加。

①样品中含有不溶于流动相的微小颗粒物。②样品在流动相中析出微小结晶。

①用0．45μm过滤膜过滤样品。②推荐使用流动相溶解样品。

10、使用—段时间后，柱效下降，分离不好。

①柱填料被流动相溶解而流失。②柱填料被样品杂质污染。①推荐使用予柱。如柱床层塌陷，用相同型号填料填补。②推荐使用保护柱或用强溶剂冲洗色谱柱除去污染杂质。

11、[b]柱使用一段时间后，柱效下降出现双峰。

柱入口床层被污染使柱填料变质。用强溶剂冲洗除去杂质。

12、柱使用—段时间后，柱效下降，出现峰拖尾。

柱入口床层被污染。用强溶剂冲洗20-30ml，若效果不明显应废弃。

13、进样量增大与峰面积增加不成正比．即进样量与峰面积不是线性关系。

样品在流动相中的溶解度小，只有部分样品被流动相冲如色谱柱中而另一部分则沉积在柱人口端。①用流动相溶解样品。②样品的浓度不宜太大。④进样量不宜过大。

14、使用缓冲液作流动相时，柱压降升高很快。

霉菌生长所致。①在流动相中加入有毒物质或加叠氯化钠防止霉菌生长。②实验结束后先用纯水后用MeOH各冲洗20-30ml后关机。

15、用5μm颗粒填料柱时，以MeOH／H20作流动相柱压较高。

MeOH与水之间由于氢键作用黏度增大。可用乙腈／水体系使柱压降低，分离效率更好。

16、长时间放置的色谱柱，出现双峰。

柱床层出现干裂。柱放置时，最好使用相应的溶剂充填好，防止受大的机械震动，如床层干裂应废弃掉。

17、流动相洗涤强度由弱渐强时出现很多杂质峰。