扫描电镜检测的步骤及方法

扫描电镜检测的步骤及方法

一、技术简介

扫描电镜是1965年发明的较现代的细胞生物学研究工具，它具有制样简单、放大倍数可调范围宽、图像的分辨率高、景深大等特点。近年来，扫描电镜已广泛地应用在生物学、医学、等学科的领域中。

主要是通过发射电子聚焦光束来扫描样品的表面形态.电子束与样品表面的样子发生作用，产生多种能够被检测的信号，这些信号就包含了样品的表面形态和组成染色。

二、实验流程

1. 样品的初步处理

a. 取材样品面积可达8mm×8mm，厚度可达5mm。对于易卷曲的样品如血管、胃

肠道粘膜等，可固定在滤纸或卡片纸上，以充分暴露待观察的组织表面。

b. 样品的清洗

(1)用等渗的生理盐水或缓冲液清洗；

(2)用5%的苏打水清洗；

(3)用超声震荡或酶消化的方法进行处理。

c. 固定：固定所用的试剂和透射电镜样品制备相同，常用戊二醛及锇酸双固

定。由于样品体积较大，固定时间应适当延长。也可用快速冷冻固定。

d. 脱水：样品经漂洗后用逐级增高浓度的酒精或丙酮脱水，然后进入中间液，

一般用醋酸异戊酯作中间液。

2. 样品的干燥

a. 空气干燥法

空气干燥法又称自然干燥法，就是将经过脱水的样品，让其暴露在空气中使脱水剂逐渐

挥发干燥。这种方法的最大优点是简便易行和节省时间；它的主要缺点是在干燥过程中，组

织会由于脱水剂挥发时表面张力的作用而产生收缩变形。因此，该方法一般只适用于表面较

为坚硬的样品。

b. 冷冻干燥法

(1)置于冷冻保护剂中：将样品置于冷冻保护剂中浸泡数小时。常用的冷冻保护

剂为10%～20%二甲基亚砜水溶液，或15%-40%甘油水溶液。

(2)骤冷：将经过保护剂处理的样品迅速投入用液氮预冷至(150℃的氟利昂冷冻

剂中，使样品中的水分很快冻结。

(3)干燥：将已冻结的样品移到冷冻干燥器内已预冷的样品台上，抽真空，经几

小时或数天后，样品即达到干燥。本方法不需要脱水，避免了有机溶剂对样品成分的抽提作用，不会使样品收缩，也是较早使用的方法。但是，由于花费时间长，消耗液氮多，容易产生冰晶损伤，因此未被广泛应用。

3. 样品的导电处理(真空镀膜法)

真空镀膜法是利用真空膜仪进行的。其原理是在高真空状态下把所要喷镀的金属加热，当加热到熔点以上时，会蒸发成极细小的颗粒喷射到样品上，在样品表面形成一层金属膜，使样品导电。喷镀用的金属材料应选择熔点低、化学性能稳定、在高温下和钨不起作用以及有高的二次电子产生率、膜本身没有结构。现在一般选用金或金和碳。为了获得细的颗粒，有用铂或用金-钯、铂-钯合金的。金属膜的厚度一般为10 nm～20 nm。真空镀膜法所形成的膜，金属颗粒较粗，膜不够均匀，操作较复杂并且费时，目前已经较少使用。

4. 拍摄。