荧光定量PCR的原理及其应用.
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
(2).良好的重复性 (3).目前合成价格较贵. (4).不能做熔解曲线分析.
一、原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
理想的PCR反应： X=X0*2n (扩增效率=1)
实际的的PCR反应： X=X0* (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
一、原理概述
6. TaqMan---水解型杂交探针工作原理
每扩增一 条DNA分子， 释放一个 荧光信号， 可以在循 环过程中 任一点检 测荧光
一、原理概述
7.探针法的优缺点
(1).极高的特异性和准确性 由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针 序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异 性。
优点：
(1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜
缺点： (1).对引物特异性要求较高 (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 需要不断的优化反 应体系,降低非特异性扩增.
一、原理概述
6. TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
TaqMan探针的特性： (1).5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
(2).3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) (3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分 开，发荧光 (4).Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
(4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green 发荧 光，在此阶段采集荧光信号。
SYBR Green
SYBR Green
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的工作原理图解
Excitati on ExBiblioteka Baiduitati on
5’
3’
SG
SG SG
S G S G S G S G S G
荧光定量PCR的原理及其应用
分子生物学实验技术
大纲
一.原理概述
二.操作及结果分析
(一).样品制备 (二).引物及探针的设计与合成 (三).标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物 (四).通道的选择及增益的选择 (五).标准曲线的建立 (六).加样时应注意的细节 (七).阈值的选定 (八).熔解曲线分析 (九).操作流程
三.应用
(一).绝对定量分析 (二).相对定量分析及实验方案 (三).SNP检测分析
一、原理概述
1.Real-Time PCR 概论
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现 了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、 自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测 同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 分析。
C(t) value
一、原理概述
3.荧光定量PCR所用的荧光报 告基团
(1).非特异性荧光标记： SYBR Green
(2).特异性荧光标记： TaqMan探针
Molecular Beacon分子信标
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的特 性
(1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 (2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激后才发 荧光 (3).变性时，DNA双链分开，无荧光
一、原理概述
2.定量PCR常用的三个常用概念
扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动 录荧光强度的变化
荧光基团
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（C ycl e）；纵坐标：荧 光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
荧光检测元件
一、原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4)
3’
SG5’
No Emission
S 5’ G 3’ S G
Emissi 3’ on 5’
伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合 而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。
一、原理概述
5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点
Ct=
-log X0 + log M log(1+Ex)
(5)
Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线性关系， 根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板 量
每个循环进行一次荧光信号的收集
一、原理概述
2.定量PCR常用的三个常用概念
扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于0.99。 (3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。
一、原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
理想的PCR反应： X=X0*2n (扩增效率=1)
实际的的PCR反应： X=X0* (1+Ex)n n：扩增反应的循环次数 X：第n次循环后的产物量 X0：初始模板量 Ex：扩增效率
一、原理概述
6. TaqMan---水解型杂交探针工作原理
每扩增一 条DNA分子， 释放一个 荧光信号， 可以在循 环过程中 任一点检 测荧光
一、原理概述
7.探针法的优缺点
(1).极高的特异性和准确性 由于探针法除了引物序列的特异性之外，还有探针 序列的特异性，从两个方面保证了所 扩增基因的特异 性。
优点：
(1).对DNA模板没有选择性----适用于任何DNA (2).使用方便-----不必设计复杂探针 (3).非常灵敏 (4).可做熔解曲线分析 (5).便宜
缺点： (1).对引物特异性要求较高 (2).与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,干扰实验的准确性,尤其 是分析表达量不高的基因时,这类情况尤其突出; 需要不断的优化反 应体系,降低非特异性扩增.
一、原理概述
6. TaqMan---水解型杂交探针
与目标序列互补
TaqMan探针的特性： (1).5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等
(2).3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) (3).探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分 开，发荧光 (4).Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
(4).复性和延伸时，形成双链DNA,SYBR Green 发荧 光，在此阶段采集荧光信号。
SYBR Green
SYBR Green
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的工作原理图解
Excitati on ExBiblioteka Baiduitati on
5’
3’
SG
SG SG
S G S G S G S G S G
荧光定量PCR的原理及其应用
分子生物学实验技术
大纲
一.原理概述
二.操作及结果分析
(一).样品制备 (二).引物及探针的设计与合成 (三).标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物 (四).通道的选择及增益的选择 (五).标准曲线的建立 (六).加样时应注意的细节 (七).阈值的选定 (八).熔解曲线分析 (九).操作流程
三.应用
(一).绝对定量分析 (二).相对定量分析及实验方案 (三).SNP检测分析
一、原理概述
1.Real-Time PCR 概论
实时荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现 了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、 自动化程度高等特点，目前已得到广泛应用。 实时荧光定量PCR：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整 个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方 法。 定量PCR仪是在普通PCR仪的基础上加装了荧光激发装置和荧光检测装置，PCR扩增和检测 同时进行，最终结果不需进行电泳检测，所以有效地避免了样品间的交叉污染。 常 规 PCR技术：对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模板 准确定量，无法对扩增反应实时检测。 实时定量PCR技术：利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产 物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量 分析。
C(t) value
一、原理概述
3.荧光定量PCR所用的荧光报 告基团
(1).非特异性荧光标记： SYBR Green
(2).特异性荧光标记： TaqMan探针
Molecular Beacon分子信标
一、原理概述
4.非特异性荧光染料---SYBR Green的特 性
(1).SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 (2).SYBR Green 只有和双链DNA结合受激后才发 荧光 (3).变性时，DNA双链分开，无荧光
一、原理概述
2.定量PCR常用的三个常用概念
扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(1).扩增曲线：反映PCR循环次数和荧光强度的曲线，定量PCR仪每次轮PCR扩增都会自动 录荧光强度的变化
荧光基团
扩增曲线图：
横坐标：扩增循环数（C ycl e）；纵坐标：荧 光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集
荧光检测元件
一、原理概述
8.荧光定量PCR的数学原理
在扩增产物达到阈值线时: XCt=X0 (1+Ex)Ct =M (1) XCt:荧光扩增信号达到阈值强度时扩增产物的量. 在阈值线设定以后,它是一个常数,我们设为M 方程式(1)两边同时取对数得: log M=log X0 (1+Ex)Ct (2) 整理方程式(2)得: log X0= - log(1+Ex) *Ct+ log M (3) log(1+Ex) *Ct= -log X0 + log M (4)
3’
SG5’
No Emission
S 5’ G 3’ S G
Emissi 3’ on 5’
伴随着每轮PCR的进行，特异的基因片段不断积累，SYBR Green不断的与新增加的基因片段结合 而发出荧光，荧光信号不断积累，荧光定量PCR仪实时记录了荧光信号的变化。
一、原理概述
5.非特异性荧光染料SYBR Green的优缺点
Ct=
-log X0 + log M log(1+Ex)
(5)
Log（x0的初始模板量）与到达阈值时的循环数（Ct值）呈线性关系， 根据样品扩增达到域值的循环数即Ct值就可计算出样品中所含的模板 量
每个循环进行一次荧光信号的收集
一、原理概述
2.定量PCR常用的三个常用概念
扩增曲线、荧光阈值、Ct值
(2).荧光阈值：样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，手动 设置的原则要大于样本的荧 光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶 段，并且保证回归系数大于0.99。 (3).CT值： PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环 次数。