hplc简介

HPLC简介

下面我要向同学们介绍的就是HPLC，即高效液相色谱。HPLC是常见的蛋白质分离技术之一。我们已经做过的实验，比如柱层析、薄层层析和纸层析就是经典的液相色谱，它们所用的固定相大多为大于100um 的吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。而今天要介绍的HPLC，就是以这些经典的液相色谱为基础，以高压下的液体作为流动相的色谱过程。

我们知道传统的液相色谱所用的固定相颗粒比较大，传质扩散相对较慢，因而柱效低，分离能力差，只能进行简单的混合物的分离，比如叶绿素的分离实验。那么相比于传统的液相色谱分离技术，HPLC究竟有什么不同呢？让我们先来了解一下高效液相色谱法的基本信息。

【基本信息】

高效液相色谱法（HPLC）是20世纪60年代后期发展起来的一种分析方法。近年来，在保健食品功效成分、营养强化剂、维生素类、蛋白质的分离测定等方面应用广泛。世界上约有80%的有机化合物可以用HPLC来分析测定。。

【分离原理】

同其他色谱过程一样，HPLC也是溶质在固定相和流动相之间进行的一种连续多次交换过程。它借溶质在两相间分配系数、亲和力、吸附力或分子大小不同而引起的排阻作用的差别使不同溶质得以分离。

简单举一个例子：

假设样品中含有A、B、C三个组分。样品随流动相一起进入色谱柱，在流动相和固定相之间进行分配。A的分配系数小，则A不易被固定相阻留，最早流出色谱柱。分配系数最大的C在固定柱上滞留时间最长，最后流出。则B就介于AC之间流出，从而达到分离的目的。

所以总的来说，HPLC的分离原理就是：在色谱柱内填充细小而均匀的固体

，而流动相携带各种蛋白质分子流经固定相，与固定相颗粒作为固定相，如C

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发生相互作用（非共价性质）。由于蛋白质间存在性质和结构上的差异，导致他们与固定相之间产生不同的作用力，最后各组分依据被保留的时间不同而顺序流

出色谱柱。通过检测器可以得到不同的峰信号，每个峰代表一个组分。

了解到HPLC的原理之后我们可以发现，其实它与经典的色谱分离并没有本质的差别。不同点仅仅是HPLC的分离效率分高。经典色谱分离法流动相在常压下输送，而HPLC则改为高压输送，色谱柱内也改为小粒径的固体颗粒因而分离效率更高。

【特点】

经过以上分析，我们可以一起来总结一下HPLC的特点。

HPLC的优点可以总结为“四高一广”。“四高”即高压、高效、高速、高灵敏度；“一广”即应用范围管。

高压和高效前面已经介绍过了，下面简单说一下高速和高灵敏度。高速是指分析速度快、载液流速快，较经典液体色谱法速度快得多，通常分析一个样品在15～30分钟，有些样品甚至在5分钟内即可完成，一般小于1小时；高灵敏度是指HPLC采用紫外检测器，可达0.01ng，进样量在μL数量级。此外高效液相色谱还有色谱柱可反复使用、样品不被破坏、易回收等等优点

当然HPLC也存在不足之处，比如它就存在“柱外效应”的缺点。所谓“柱外效应”是指在从进样到检测器之间，除了柱子以外的任何死空间（进样器、柱接头、连接管和检测池等）中，如果流动相的流型有变化，被分离物质的任何扩散和滞留都会显著地导致色谱峰的加宽，柱效率降低。此外，高效液相色谱检测器的灵敏度不及气相色谱。

【结构组成】

在了解了HPLC的特点之后，我们一起来熟悉一下HPLC的结构组成：主要可以分为五个部分：“高压输液泵”、“色谱柱”、“进样器”、“检测器”、“馏分收集器”以及“数据获取与处理系统”。下面简单介绍各部分的功能：高压输液泵的功能为驱动流动相和样品通过色谱分离柱和检测系统；

色谱柱就是分离样品中的各个物质；

进样器可将待分析样品引入色谱系统；

检测器的功能就是将被分析组在柱流出液中浓度的变化转化为光学或电学信号；

最后如果所进行的色谱分离不是为了纯粹的色谱分析，而是为了做其它波谱

鉴定，或获取少量试验样品的小型制备，馏分收集是必要的；

数据获取和处理系统能把检测器检测到的信号显示出来。

整个分析过程可以总结为：由泵将储液瓶中的溶剂吸入色谱系统，然后输出，经流量与压力测量之后，导入进样器。被测物由进样器注入，并随流动相通过色谱柱，在柱上进行分离后进入检测器，检测信号由数据处理设备采集与处理，并记录色谱图。废液流入废液瓶。遇到复杂的混合物分离（极性范围比较宽）还可用梯度控制器作梯度洗脱。

到这里，大家是不是对HPLC有了比较全面的了解呢？下面再为大家介绍几种HPLC的类型。

【类型】

主要类型有 1.吸附色谱法；2.分配色谱法：又可分为正相分配色谱和反相分配色谱；3.离子交换色谱法；4.凝胶色谱，也叫排阻色谱或粒度排阻色谱。此外还有键和相色谱法和亲和色谱法。每一中方法各有其特点。

【反向高效液相色谱】

最后为大家介绍一下反向高效液相色谱（RP-HPLC）技术。

RP-HPLC与HPLC基本类似，主要不同在于两个方面：

；

1.它们的固相极性不同:HPLC色谱柱内固相颗粒表面为极性材料，如C

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键合一些烃基，降低极性。

RP-HPLC对固体颗粒表面进行处理，令C

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2.它们的流动相极性不同：HPLC流动相极性小，常用有机溶剂。而RP-HPLC

流动极性大，一般为甲醇、乙腈的水溶液。

正因为这两个方面的差别，使得在HPLC中极性小的分子先洗脱下来，而

RP-HPLC正相反，极性越大移动速度越快。

另外，RP-HPLC具有很高的分辨率，可以分离相差一个氨基酸残基的蛋白质或多肽。早在1983年，就有科学家利用RP-HPLC分离了人胰岛素和兔胰岛素，二者只有一个甲基的差异。

大家看PPT上展示的就是利用RP-HPLC技术对小麦醇溶蛋白进行的有效分离。它利用贮藏蛋白各组分键合相表面疏水性差异对单体醇溶蛋白和经还原处理后的单体谷蛋白亚基进行有效分离，使ω、“β\α、γ-醇溶蛋白和高、低分子量谷蛋白亚基区域分开。