(整理)免疫荧光技术.ppt

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常见荧光素的特性：
⑴ FITC：黄色结晶粉末，吸收光：490~495nm， 发射光：520~530nm，明亮的黄绿色荧光。
⑵ RB200： 橘红色粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红色荧光。
⑶ TRITC： 紫红色粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红色荧光。
1 荧光素与抗体结合（标记） 2 荧光抗体的纯化 3 荧光抗体的鉴定
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1 荧光素与抗体结合方法： ⑴ 透析法：①适用于蛋白质含量低、样品体 积小的抗体溶液的标记 ②标记较均匀，非特异荧光较 低
⑵ 搅拌法：①适用于蛋白质含量较高、样品
体积较大的抗体溶液的标记
②标记时间短、效率较高，荧 光
细胞采用涂片、印片或切片的方式制备抗 原片。
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2 标本的固定： ⑴ 固定目的
防止细胞、细菌或切片从玻片上脱落。
去除组织中妨碍抗原抗体结合的类脂质。
易于保存。
（但CD、SIg的检测不进行固定，而采 用活细胞染色）。
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⑵ 常用的固定方法：
抗原
固定剂
蛋白质
95%乙醇
Ig类
------化学发光技术
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4 荧光素的荧光特性：
⑴ 停止供能，荧光现象随即终止 ⑵ 对光的吸收和荧光的发射具高度选择性
入射光波长<发射光波长 ⑶ 荧光效率： 发射荧光的光量子数
荧光效率= 吸收光的光量子数
⑷ 荧光猝灭现象：荧光素的辐射能力减弱
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5 常见荧光素：
⑴ FITC ⑵ RB200 ⑶ TRITC ⑷ 镧系：Eu、Tb ⑸ PE ⑹ 其它
将含40mg/ml BP 溶液5ml 装入反应瓶中。
加入pH=9.0、0.5mol/L碳酸盐 缓冲液4ml 25℃磁力搅拌下，逐滴加入 1ml含2mg的FITC溶液
25℃下搅拌1h，4℃下继续搅拌 4h，然后进行纯化、鉴定。
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2 荧光抗体的纯化： ⑴ 除去未结合荧光素 ⑵ 除去标记不适当的抗体 ⑶ 除去非特异反应物质
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⑴ 除去未结合荧光素：
A 透析法： 将标记后的抗体溶液装于透析袋，于流 动的自来水中透析约10min，然后移入 pH=7.4的磷酸盐缓冲液中，在4℃下透析， 直至透析外液在紫外灯下不呈现荧光为 止。
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B 凝胶过滤法：
葡聚糖凝胶G25或G50，用pH=7.4的 0.01%PBS溶胀后装柱，加入标记后的 抗体溶液，然后用上述PBS洗脱，取洗 脱液加入20%三氯醋酸使蛋白沉淀后， 上清液中的荧光素应低于0.01ug/ml。
免疫荧光技术
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一、一些基本概念和基本知识：
1 荧光免疫测定技术的概念：将试剂抗原 或试剂抗体用荧光素进行标记，试剂与 标本中相应的抗体或抗原反应后，测定 复合物中的荧光素，这种免疫技术，称 为免疫荧光素技术。
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2.技术分类： ⑴荧光抗体技术(荧光显微镜技术) 抗原抗体反应后，利用荧光显微镜判 定结果的检测方法。
⑷ 镧系：Eu、Tb
⑸ PE：吸收光490~560nm，发射光595nm，红
色 荧光。
⑹ 其它：酶作用后产....生. 荧光物质。
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酶作用后产生荧光物质： 酶 底物 产物 激发光
Β-G MUG MU 360 AP MUP MU 360 HRP HPA 二聚体 317
发射光 450 450 414
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素用..量... 节省
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透析法
第一步： 将含10mg/ml的Ig溶液10ml 装入透析袋。
第二步： 将上述透析袋放入烧杯中 ：
含0.1mg/ml FITC的 pH=9.4的碳酸盐缓冲液 100ml。 第三步： 4℃磁力搅拌24h。 第四步： 取出透析袋，进行纯化、鉴定。
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搅拌法
第一步： 第二步： 第三步： 第四步：
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⑵ 除去标记不适当的抗体：
采用DEAE纤维素离子柱。将DEAE 纤维素用pH=7.6的0.01mol/L磷酸盐缓冲 液平衡装柱，加入标记抗体溶液，进行 分步洗脱。
未结合荧光素的抗体，所帶负电少， 最先洗出。
过量结合荧光素的抗体，所帶负电多， 最后洗出。
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⑶ 除去非特异反应物质：
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6 合适荧光素的选择 ⑴ 具有与蛋白质形成共价键的化学基团。
荧光素-N=C +NH-蛋白质 ‖︱
荧光素-N-C-N-蛋白质 ︱‖ ︱
SH
HSH
⑵ 荧光效率高，标记后下降不明显。
⑶ 荧光色泽与背景色泽对比鲜明。
⑷ 标记后能保持生物学活性和免疫活性
⑸ 标记方法简单、快速。
⑹ 安全无毒
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二、 荧光抗体的制备
* F/P值高则抗体分子结合的荧光素多。
* 固定标本染色以F/P=1.5左右为宜
* 活细胞染色以F/P=.2.....4左右为宜
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三、荧光抗体技术：
㈠抗原片的制作 ㈡试验类型 ㈢荧光显微镜检查
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㈠抗原片的制作
1 制作： 临床常见的标本有组织、细胞细菌三大类。
可采用涂片、印片或切片方式制备抗原片。
甲醇
酶类
丙酮
激素 类脂质
CCl4 10%福尔马林
多糖(细菌) 10%福尔马林
丙酮、甲醇
病毒
无水乙醇
4℃30~60min
丙酮、CCl4
固定方法
室温3~10min或4℃30min 同上 同上 同上
室温3~10min 室温3~10min或4℃30min
室温5~10min或
将荧光抗体用同一正常组织或同种动物其 它组织的组织粉预先吸收。
按100mg组织粉/ml标记抗体比例混合， 4℃磁力搅拌1h，静置1h，离心取上清液， 在用50mg/ml比例重复一次。
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3 荧光抗体的鉴定： ⑴ 抗体含量测定：双扩法
⑵ 结合比率(F/P)测定：
分光光度法，并按下式计算：
0.3F5I×TCA:495)F/P=2.87×A495/(A280RB和TRITC: F/P= A515 / A280
⑵ 免疫荧光测定技术： 抗原抗体反应后，利用特殊仪器测定 荧光强度而推算被测物浓度的检测方法
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3 荧光的产生： 物质吸收外界能量而进入激发状态，
在回复基态时多余的能量以电磁辐射的形 式释放，即发光，这种光称为荧光。
这种物质，称为荧光素
由光激发所引起的荧光，为光致荧光
------荧光免疫技术 由化学反应所引起的荧光，为化学荧光