SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
表达载体与毕赤酵母基因 组发生重组的两种方式：
1. 载体的3' AOX1区与基因组的 AOX1基因的末端发生整合重组
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4 基因的末端发生整合重组
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
甲醇酵母系统高效表达影响因素
➢ 载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上 ➢ 基因剂量：单/多拷贝 ➢ 甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)， Mut+ (利用甲醇快型) ➢ mRNA5′端：应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构 ➢ AT含量：AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构 ➢ 表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
➢ TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； ➢ HIS4为营养缺陷型筛选标志； ➢ 3' AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源
重组； ➢ 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载 SDS体聚在丙E烯.酰co胺li中凝筛胶电选泳和复制。
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
0.74495X6
(2)
➢ 这里的X1, X2, X3, X4, X5 和X6分别代表区间[18,123]，[31,140]，[35,150]，[90,118]， [90,151]和[95,135]的用RNAfold软件计算的最低自由能（计算温度参数设为30℃）。
➢ 对于每个新数据，为了预测该基因是否能在酵母中高效表达（表达水平大于100
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
微观的酵母细胞
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构
➢ 5'AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱 导下可启动外源蛋白的表达；
➢ α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列， 能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白 的纯化；
➢ 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提 供位点；
➢ 几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其 它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营 养来源。
➢ 由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤 坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
用该软件来预测NGAL在毕赤酵母高效表达的概率
➢ 截取NGAL cDNA 3‘末端最后100bp碱基（包括终止密码子TGA），与pPIC9载 体EcoR I位点后100bp碱基（包括EcoR I位点）组成200bp的序列片段，
mg/L），可先计算这6个区间的最低自由能，然后运算上述的1,000个判别函数，来评
估该基因高效表达的概率。如果在这1,000次的判别分析中，有500次或以上的HEG1大
于LEG1，那么这个外源基因为一个表达水平大于100 mg/L的基因，否则就是个表达水
平低于100 mg/L的基因。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
模型构建原理
➢ 收集40例应用pPIC9载体在毕赤酵母GS115株中表达目的基因的数据。拟定以表达量100 mg/L为界限，将40例目的基因表达水平分为高/低两组。
➢ 确认表达载体的翻译终止密码子前后各100bp的序列，据此对每个数据构建200bp的片段。 ➢ 从上述每个基因的200bp片段，截取9,000个区间，截取方式为[X, Y], X和Y在200bp片段的
凝胶电泳分离分析鉴定 3. 第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表
达的概率
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测
➢ 在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大 规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。
➢ 酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加 工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。
如此重复1,000次，这样我们得到了1,000个判别函数，如第一个判别函数为：
HEG1=－20.20203＋0.52552X1－2.35843X2＋1.53122X3－2.24870X4－1.19898X5＋
1.53908X6
(Βιβλιοθήκη Baidu)
LEG1=－14.37028＋0.00749X1－0.04135X2－0.87256X3＋2.02204X4＋0.15215X5 －
综合性设计性实验-2
外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测 表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定 分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
此实验共包括如下三个部分
1. 第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测 2. 第二部分：毕赤酵母蛋白表达产物的SDS聚丙烯酰胺
范围为1≤X≤100, 和111≤Y≤200。
➢ 使用RNAfold软件对每个区间计算最低自由能，构建最低自由能矩阵。 ➢ 使用Tclass程序对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高
低的6个区间组合。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
➢ 我们将40例数据按75％的比例随机分成两组，多数组应用上述6个区间来建立判别函数，
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
外源基因的3'末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比
较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京
军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达
的数学模型。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
分析流程：
1. 在“sequence”方框中输入由目的基因末端100bp及其后面的载体100bp组成的200bp序列片段； 2. 点击底下的“Evaluation”按钮，在“Evaluation”方框中显示预测的结果； 3. 如果结果显示低于0.5，则可点击“Design”这个按钮，则显示根据密码子使用改造后的序列。
表达载体与毕赤酵母基因 组发生重组的两种方式：
1. 载体的3' AOX1区与基因组的 AOX1基因的末端发生整合重组
2. 载体的HIS4区与基因组的HIS4 基因的末端发生整合重组
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
甲醇酵母系统高效表达影响因素
➢ 载体稳定性：是整合还是粘附到酵母染色体上 ➢ 基因剂量：单/多拷贝 ➢ 甲醇利用表型：Muts(利用甲醇慢型)， Mut+ (利用甲醇快型) ➢ mRNA5′端：应尽量避免在UTR区出现AUG和次级结构 ➢ AT含量：AT含量越高、越容易出现类似于终止子的结构 ➢ 表达产物稳定性：分泌表达时，胞外蛋白酶是要影响因素
➢ TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号； ➢ HIS4为营养缺陷型筛选标志； ➢ 3' AOX1 基因片段能够与基因组AOX1基因属同源
重组； ➢ 抗Amp 基因和pBR322能使空载体和构建的表达载 SDS体聚在丙E烯.酰co胺li中凝筛胶电选泳和复制。
pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点
0.74495X6
(2)
➢ 这里的X1, X2, X3, X4, X5 和X6分别代表区间[18,123]，[31,140]，[35,150]，[90,118]， [90,151]和[95,135]的用RNAfold软件计算的最低自由能（计算温度参数设为30℃）。
➢ 对于每个新数据，为了预测该基因是否能在酵母中高效表达（表达水平大于100
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
微观的酵母细胞
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构
➢ 5'AOX1 启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱 导下可启动外源蛋白的表达；
➢ α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列， 能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白 的纯化；
➢ 多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提 供位点；
➢ 几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichia pastoris, Pp)，因具有旺盛的生长力以及其 它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营 养来源。
➢ 由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤 坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
用该软件来预测NGAL在毕赤酵母高效表达的概率
➢ 截取NGAL cDNA 3‘末端最后100bp碱基（包括终止密码子TGA），与pPIC9载 体EcoR I位点后100bp碱基（包括EcoR I位点）组成200bp的序列片段，
mg/L），可先计算这6个区间的最低自由能，然后运算上述的1,000个判别函数，来评
估该基因高效表达的概率。如果在这1,000次的判别分析中，有500次或以上的HEG1大
于LEG1，那么这个外源基因为一个表达水平大于100 mg/L的基因，否则就是个表达水
平低于100 mg/L的基因。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
模型构建原理
➢ 收集40例应用pPIC9载体在毕赤酵母GS115株中表达目的基因的数据。拟定以表达量100 mg/L为界限，将40例目的基因表达水平分为高/低两组。
➢ 确认表达载体的翻译终止密码子前后各100bp的序列，据此对每个数据构建200bp的片段。 ➢ 从上述每个基因的200bp片段，截取9,000个区间，截取方式为[X, Y], X和Y在200bp片段的
凝胶电泳分离分析鉴定 3. 第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表
达的概率
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测
➢ 在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大 规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。
➢ 酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加 工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。
如此重复1,000次，这样我们得到了1,000个判别函数，如第一个判别函数为：
HEG1=－20.20203＋0.52552X1－2.35843X2＋1.53122X3－2.24870X4－1.19898X5＋
1.53908X6
(Βιβλιοθήκη Baidu)
LEG1=－14.37028＋0.00749X1－0.04135X2－0.87256X3＋2.02204X4＋0.15215X5 －
综合性设计性实验-2
外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测 表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定 分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
此实验共包括如下三个部分
1. 第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测 2. 第二部分：毕赤酵母蛋白表达产物的SDS聚丙烯酰胺
范围为1≤X≤100, 和111≤Y≤200。
➢ 使用RNAfold软件对每个区间计算最低自由能，构建最低自由能矩阵。 ➢ 使用Tclass程序对最低自由能矩阵进行t检验及判别分析，得到理论上可以判别表达水平高
低的6个区间组合。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
➢ 我们将40例数据按75％的比例随机分成两组，多数组应用上述6个区间来建立判别函数，
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
外源基因的3'末端的最低自由能稳定性对于实现目的基因在毕赤酵母中成功高效表达是比
较重要的因素，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组联合北京
军事医学科学院李伍举教授课题组建立了一个针对pPIC9表达载体在毕赤酵母中高效表达
的数学模型。
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
外源基因在毕赤酵母表达系统中高效表达预测的网页服务器
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳
分析流程：
1. 在“sequence”方框中输入由目的基因末端100bp及其后面的载体100bp组成的200bp序列片段； 2. 点击底下的“Evaluation”按钮，在“Evaluation”方框中显示预测的结果； 3. 如果结果显示低于0.5，则可点击“Design”这个按钮，则显示根据密码子使用改造后的序列。