转基因植物技术的鉴定

技术路线 目的基因分离 植物表达载体的构建 遗传转化 受体材料的准备 转化组织
炼苗
转化植株筛选
组织脱分化
1.目的基因的分离 目的基因的分离
（1）已知基因的获得 ）
①化学合成法 ②PCR扩增
（2）未知基因的获得 ）
①构建基因组文库，筛选目的基因 ②构建cDNA文库，筛选目的基因 ③mRNA差异显示技术筛选差异表达基因 ④差异蛋白质谱表达技术筛选功能基因 ……
但进去的DNA片段整合效率 片段整合效率 但进去的 极低，不易获得再生植株， 极低，不易获得再生植株，可能 发生共抑制现象. 发生共抑制现象
电击法的主要原理是 将原生质体在溶液中与 DNA混合,然后利用高压 电脉冲作用,使原生质体 膜的某些部位被击穿而 产生可回复的小孔,外源 DNA可通过小孔进入原 生质体内,而且不影响经 电击处理的原生质体再 生植物的能力. 转化效率较低， 转化效率较低，且仅 限于能由原生质体再生 出植株的植物。 出植株的植物。
3.受体材料的准备 细胞的全能性：分化细胞脱分化
再分化
4.遗传转化
（1）间接转化法 ）间接转化法——农杆菌介导转化法 农杆菌介导转化法 （2）直接转化法 A、 基因枪转化法 B、 电击法 C、花粉管通道法 D、 PEG介导基因转化法
根癌农杆菌
(Agrobacterium tumefaciens),
表1 几种植物转基因方法比较
转基因方法
DNA间接转化法 农杆菌介导基因 转移
转化的优点
转化的缺点
受体种类，可以在原生质体、 转化双子叶植物为主。大 蛋细胞和细胞团、组织器官 多数单子叶植物和裸子植 或整株等多级水平上进行， 物对农杆菌的侵入不敏感， 方法成熟可靠，简便易行， 限制了该法在禾谷类作物 周期短，转化率高； 中的应用。 转化体常出现“嵌合”现 象，需在严格条件下加以 选择以淘汰未转化细胞
2.植物表达载体的构建 植物表达载体的构建
④
pGEM-T
⑤ ⑥ ⑥
① ②
①银杏叶RNA提取 银杏叶RNA提取 ②反转录cDNA 反转录 全长cDNA的克隆 ③chs全长 全长 的克隆 ④TA克隆及测序 克隆及测序
③
⑦
⑤向chs两端引入酶切位点 两端引入酶切位点 ⑥双酶切 ⑦定向克隆 ⑧导入农杆菌
⑧
花粉管通道法是利用 开花植物授粉后形成的 花粉管通道,直接将外 源目的基因导入尚不具 备正常细胞壁的卵、合 子或早期胚胎细胞,实 现目的基因转化.
PEG介导基因转化的主要原理是聚乙二醇 (PEG)、多聚-L-鸟核苷酸(pLO)、磷酸钙及高 pH值条件下诱导原生质体摄取外源DNA分 子.PEG可促使细胞膜与DNA间接触与粘连, 并通过引起膜表面电荷的紊乱及干扰细胞间 的识别,利于细胞膜间的融合以及外源DNA进 入原生质体.
GUS基因所编码的β-葡萄糖酸苷酶可催化裂解人工合成的底物 4-甲基伞形花酮-β-D-葡萄糖苷酸，产生荧光物质4-甲基伞形酮， 可用荧光光度计进行定量测定。
其它报告基因
荧光素酶（LUC）基因 二氢叶酸还原酶（DHFR）基因 抗除草剂Basta（bar）基因 胭脂碱、章鱼碱基因 新霉素磷酸转移酶（NPT-Ⅱ）基因 潮霉素磷酸转移酶（HPT）
转基因植物技术的鉴定
组员：魏翠芳、杨帆、甘小东、孙圆圆、 王翠华、张辉、曹盼、王凯、罗青帮 田晓瑞、马小莉、王亚平、袁源
转基因技术
将人工分离和修饰过的基因导入到生物体基因组 中，由于导入基因的表达，引起生物体的性状的 可遗传的修饰，这一技术称之为转基因技术 （Transgene technology）。 ）
带有转化基因的农杆菌活化
共培养 侵染 叶盘 受体植物
诱导成苗
遗传转化主要的影响因素： 遗传转化主要的影响因素：
1.预培养时间：一般0~3天，过长不利于侵染 2.农杆菌浓度：用MS（pH=7.0）盐溶液调OD值（一般在 0.2~1.0） 3.侵染时间：时间应适中，太短转化率低；太高则后期农杆 菌难以除净，毒害材料。 4.共培养时间 5.乙酰丁香酮（AS）处理：处理方式及浓度 (A) 仅共培养基中加AS (B) 仅菌液中加AS 实验结论： 实验结论：A与C效果最好且差异不明显 (C) 菌液和共培养基中均加AS AS使用浓度：50µM~200µM
杂交鉴定
☺外源基因整合的 Southern 杂交鉴定 ☺外源基因转录的 Northern杂交检测 ☺外源基因表达蛋白的检 测 ☺外源基因整合及表达的 原位杂交检测 Southern杂交过程 Southern杂交过程
8.转基因植物的应用
植物基因改良 抗虫害植物、抗除草剂植物、 抗虫害植物、抗除草剂植物、高品质植物 转基因植物生产药物
转 基 因 植 物
富含维他命A的黄金大米 富含维他命 的黄金大米
转基因棉花（ 基因 基因） 转基因棉花（Bt基因）
抗虫玉米百度文库
转基因番茄（抗花叶病基因） 转基因番茄（抗花叶病基因）
1983 年 美国和比利时科学家首次将外源基因导入烟草和胡 萝卜。 萝卜。 1994 年 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市。 世界上第一种耐储藏的番茄在美国批准上市。 1995 年 转基因的抗虫、抗除草剂的玉米和棉花在美国投入 转基因的抗虫、 生产。 生产。 2000 年 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆。 美国转基因大豆的种植面积首次超过普通大豆。 迄今为止 世界上共批准了12种作物、6大类性状的 个转基 世界上共批准了 种作物、 大类性状的48个转基 种作物 大类性状的 因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、 因品种进行商业化生产，其中包括水稻、玉米、马铃薯、小 黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、 麦、黑麦、红薯、大豆、豌豆、棉花、向日葵、油菜、亚麻 甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、 、甜菜、甘草、卷心菜、番茄、生菜、胡萝卜、黄瓜、芦笋 苜蓿、草莓、木瓜、猕猴、 越橘、茄子、 苹果、 、苜蓿、草莓、木瓜、猕猴、桃、越橘、茄子、梨、苹果、 葡萄等。 葡萄等。
应用于生产转基因药物的植物
药物名称 核糖体抑制蛋白 血管紧张肽转化 酶 抗体 抗原 脑啡肽 表皮生长因子 促红细胞生成素 生长激素 水蛭素 人血清蛋白 干扰素 基因来源 恬楼、玉米 牛奶 老鼠 细菌、病毒病原 人 人 人 鲑鱼 合成 人 人 应用 抑制HIV 抗过敏 多种用途 口服疫苗 止痛、镇定剂 特殊细胞增值 调节红细胞水平 刺激生长 血栓抑制剂 血栓扩张剂 抗病毒 植物载体 烟草 烟草、番茄 烟草 烟草、马铃薯、 番茄 油菜、拟南芥 烟草 烟草 烟草、拟南芥 油菜 烟草、马铃薯 芜芩
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基因枪转化法由美国Cornell大学的 Sanfor (1987)提出,它的主要原理是将包 含目的基因的载体包被在微小的金属微 粒(钨粒或金粒)表面,通过高压驱动力加 速微粒穿透植物细胞壁,导入受体组织细 胞内,然后通过组织培养再生出完整的植 株.微粒上的外源DNA进入细胞后,整合到 染色体上并得到表达,从而实现基因的转 化.。
6.炼苗
7、转基因植物的鉴定 、
个体水平鉴定
个体水平上鉴定利用遗传学和育种学方法，即种植或诱导转化体表现其 性状特征或生理特征。
细胞和组织水平鉴定
报告基因：指其编码产物能够被快速的测定，常用来判断外源基因是否 报告基因： 已经成功地导入寄主细胞（器官或组织）并检测其表达活性的一类特殊 用途的基因。 一个理想的报告基因，最基本的要求是在转化的寄主细胞中应不存在 相应的内源等位基因的活性，其表达产物不仅不会损害寄主细胞，而且 应该快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。
是一种革兰氏阴性土壤杆菌,
它含有Ti质粒,能诱导被侵 染的植物细胞形成肿瘤, 即诱发冠瘿瘤.Ti质粒(包 括Ri质粒)上有一段转移 DNA,在农杆菌侵染宿主 植物时,这段DNA可以转 移进植物细胞,并稳定地 保留在植物细胞染色体中, 变为植物细胞新增加的一 群基因,最终能通过有性 世代遗传给子代 。
无宿主限制，适用于各种单、 转化效率低，需要专门设 备（电击仪、显微操作仪 （1）基因枪转化法 双子叶植物，操作简单 或基因枪），多数需要原 （2） 电击法 生质体与愈伤组织，周期 （3） PEG介导基 太长（电击法） 因转化法 DNA直接转化法
（4）花粉管通道法
5.转化组织 ——农杆菌介导之叶盘转化法
1. 绿色荧光蛋白（GFP）基因 . 绿色荧光蛋白（ ） 特点：可在荧光显微镜或流式细胞仪中直接观察 特点 基因的表达。
氯霉素乙酰转移酶（ 2. 氯霉素乙酰转移酶（CAT）基因 ）
缺点：信号没有NPT-II强 优点：克服了受体细胞非特异性酶本底较 高的缺点，且CAT酶定量分析很准确。
3.β-葡萄糖酸苷酶（GUS）基因 3.β-葡萄糖酸苷酶（GUS）