第二章发酵液的预处理和固液分离方法

改善发酵 液过滤特 性的物理 化学方法
调酸(等电点) 热处理 电解质处理 添加凝聚剂 添加表面活性物质 添加反应剂 冷冻－解冻 添加助滤剂
一、降低液体粘度
根据流体力学原理，滤液通过滤饼的速 率与液体的粘度成反比，降低液体粘度就可 有效提高过滤速率。
降低液体粘度的常用方法 加水稀释法 加热法
加水稀释法
直接加入发酵液
使用时需要一个带搅拌器 的混合槽，充分搅拌混合 均匀，防止分层沉淀。
两种方法同时兼用
五、加入反应剂
加入某些不影响目的产物的反应剂， 可消除发酵液中某些杂质对过滤的影 响，从而提高过滤速率。
加入反应剂，可以和某些可溶性盐类发 生反应生成不溶性沉淀，如CaSO4、AlPO4 等。
生成的沉淀能防止菌丝体粘结，使菌丝 具有块状结构，沉淀本身可作为助滤剂，并 且能使胶状物和悬浮物凝固，从而改善过滤 性能。
应用实例：
在膜过滤中，发酵液中的大分子物质易 与膜发生吸附，通过调整pH值改变易吸附 分子的电荷性质，即可减少堵塞和污染。
细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某 个pH值下也可能趋于絮凝而成为较大颗粒， 有利于过滤的进行。
三、凝聚与絮凝
作用：
采用凝聚和絮凝技术能有效改变大分子物 质的分散状态，使其聚结成较大的颗粒，便 于提高过滤速率；
正确选择反应剂和反应条件，能使过滤 速率提高3~10倍。
应用实例：
在新生霉素发酵液中加入氯化钙和磷 酸钠，生成的磷酸钙沉淀可充当助滤剂， 另一方面可使某些蛋白质凝固。
环丝氨酸发酵液用氧化钙和磷酸处理， 生成磷酸钙沉淀，能使悬浮物凝固，多余 的磷酸根离子还能除去钙、镁离子，并且 在发酵液中不会引入其他阳离子，以免影 响环丝氨酸的离子交换吸附。
如果在发酵液中加入具有相反电性的 电解质，就可以中和胶粒的电性，使ξ电 位降低，胶体体系变得不稳定。
当双电层的排斥力不足以抗衡胶粒间 的范德华引力时，由于热运动的结果就导 致胶粒的互相碰撞而聚集。
另外，由于电解质离子在水中的水化 作用会破坏胶粒周围的水化层，使胶粒可 以直接碰撞而聚集。
影响凝聚作用的主要因素是无机盐的种类、 化合价以及无机盐的用量。
该法是发酵工业中发酵液预处理中 常用的方法之一。
氨基酸、蛋白质等两性物质，在其等电点处的 溶解度最小，此即为等电点沉淀法。
应用实例：味精生产中，利用等电点 (pH3.22)沉淀法提取谷氨酸；对于蛋白质，由 于羧基的电离度比氨基大，故蛋白质的酸性性 质通常强于碱性，因而大多数蛋白质的等电点 都在酸性范围内(pH 4.0～5.5)。利用酸性来调 节发酵液pH值使之达到等电点，可除去蛋白质 等酸性两性物质。
优点：降低液体粘度 缺点：增加悬浮液的体积，加大
后继过程的处理任务。
加热法
优点：1. 升高温度可有效降低液体粘度，提高 过滤速率；
2. 在适当温度和受热时间下可使蛋白质 凝聚，形成较大颗粒的凝聚物，进 一步改善了发酵液的过滤特性。
实例：链霉素发酵液，调酸至pH3.0后，加热 至70℃，维持半小时，液相粘度下降至 原来的1/6，过滤速率可增大10～100倍。
第二章 发酵液的预处理 和固液分离方法
发酵液预处理的目的
①改变发酵液的物理性质，提高固液 分离效率；
②尽可能使产物转入便于后处理的某 一相中(多为液相)；
③去除发酵液中部分杂质，以利于提 取和精制后续各工序的顺利进行。
2.1 发酵液过滤特性的改变
微生物发酵液的特性
① 发酵产物浓度较低，而且悬浮液中大部分是水； ② 悬浮物颗粒小，相对密度与液相相差不大； ③ 固体粒子可压缩性大； ④ 液相粘度大，大多为非牛顿型流体； ⑤ 性质不稳定，随时间变化。
它们通过静电引力、范德华力或氢键的作用， 强烈地吸附在胶粒的表面。当一个高分子聚合物 的许多链节分别吸附在不同的胶粒表面上，产生 桥架联接时，就形成了较大的絮团，这就是絮凝 作用。
对絮凝剂的化学结构一般有下列要求:
分子必须含有相当多的活性官能团，使之 能和胶粒表面相结合；
必须具有长链的线性结构，以便同时与多 个胶粒吸附形成较大的絮团，但絮凝剂的 相对分子量不能超过一定限度，以使其具 有良好的溶解性。
镁离子的去除：
可加入三聚磷酸钠，它和镁离子 形成可溶性络合物后，即可消除对离 子交换的影响。
Na5P3O10 + Mg2+
MgNa3P3O10 + 2Na+
发酵液中铁离子的去除：
加入黄血盐，可与铁离子形成普 鲁士蓝沉淀而除去。
二、杂蛋白质的除去
在改善发酵液过滤特性的众 多方法中，有许多可在改善过滤 特性的同时，除去杂蛋白质。
四、加入惰性助滤剂
助滤剂是一种不可压缩的多孔微粒， 它能使滤饼疏松，滤速增大。
使用助滤剂后，悬浮液中大量的细微 胶体粒子被吸附到助滤剂的表面上，从而 改变了滤饼结构，它的可压缩性下降，过 滤阻力降低。
常用的助滤剂
硅藻土、纤维素、石棉粉、珍 珠岩、白土、炭粒、淀粉
助滤剂的使用方法：
在过滤介质表面预涂助滤剂
根据静电学基本定理，可推导ξ电位的基
本公式为
R
2 0
R12
( R0 R1 )( R0 R1 )
ln( R0 / R1 ) ln 1 ( R0 R1 ) / R1
(R0
( R0
R1 )( R0 R1 )
R1 ) / R1
R1 (R0 R1 )
2R2
（2－1）
q：胶体的电动电荷密度，即滑移面上的电荷密
这种包括凝聚和絮凝机理的过程， 称为混凝。
对于非离子型和阴离子型高分子絮凝剂， 则可以与无机电解质凝聚剂搭配使用。
首先加入电解质，使悬浮粒子间的双电 层电位降低、脱稳，凝聚成微粒，然后再加 入絮凝剂絮凝成较大的颗粒。无机电解质的 凝聚作用为高分子絮凝剂的架桥创造了良好 的条件，从而大大提高了絮凝的效果。
根据其活性基团在水中解离情况 的不同，絮凝剂可分为: ➢ 非离子型 ➢ 阴离子型 ➢ 阳离子型
根据其来源的不同又可分为如下三类：
(1) 有机高分子聚合物，如聚丙烯酰胺类衍生 物、聚苯乙烯类衍生物。
(2) 无机高分子聚合物，如聚合铝盐、聚合铁 盐等。
(3) 天然有机高分子絮凝剂，如聚糖类胶粘物、 海藻酸钠、，明胶、骨胶、壳多糖、脱乙 酰壳多糖等。
2．絮凝
絮凝是指在某些高分子絮凝剂存在 下，基于架桥作用，使胶粒形成较大絮 凝团的过程。
采用凝聚方法得到的凝聚体，其颗 粒常常是比较细小的，有时还不能有效 地进行分离。采用絮凝法则常可形成粗 大的絮凝体，使发酵液较易分离。
絮凝剂是一种能溶于水的高分子聚合物，其 相对分子质量可高达数万至一千万以上，它们具 有长链状结构，其链节上含有许多活性官能团， 包括带电荷的阴离子(如-COOH)或阳离子(如NH2)基团以及不带电荷的非离子型基团。

从上两式可知，ξ电位与溶液 中带相反电荷的离子强度有关， 因此，提高离子的化合价和浓度 可以压缩扩散双电层，使其厚度 减小，从而使ξ电位降低。
电解质的凝聚能力可用凝聚值来表 示，使胶粒发生凝聚作用的最小电解 质浓度（mol/L）称为凝聚值。
根据Schuze-Hardy法则，反离子 的价数越高，该值就越小，即凝聚能 力越强。
滑移面上的电位称为ξ电位（或电动电位）， 它是控制胶粒间电排斥作用的电位，用来表征双 电层的特征，是研究凝聚机理的重要参数。
胶粒保持分散状态的原因
带有相同电荷和扩散双电层的结构。 ξ电位越大，电排斥作用就越强，胶粒的分 散程度也越大，发酵液过滤就越困难。
胶粒表面的水化作用，形成了包围 于粒子周围的水化层，也能阻碍胶粒间的 直接聚集。
1. 沉淀法
蛋白质是两性物质，
在酸性溶液中，能与一些阴离子如三氯乙 酸盐、水杨酸盐、钨酸盐、苦味酸盐、鞣酸 盐、过氯酸盐等形成沉淀；
在碱性溶液中，能与一些阳离子如Ag＋、 Cu2＋、Zn2＋、Fe3＋和Pb2＋等形成沉淀。
2. 变性法
使蛋白质变性的方法很多，其中最常 用的是加热法。加热不仅使蛋白质变性， 同时降低液体粘度，提高过滤速率。
如果发酵液中含有不溶性多糖物质，则最 好用酶将它转化为单糖，以提高过滤速率。
例如万古霉素用淀粉作培养基，发酵液过 滤前加入0.025％的淀粉酶，搅拌30min后， 再加2.5％硅藻土助滤剂，从而可使过滤速率 提高5倍。
2.2 发酵液中部分杂质的去除
在预处理时，必须采用适当的方法 使这些杂质沉淀，在固液分离时除去， 以利于后提取与精制过程的顺利进行。
阳离子对带负电荷的发酵液胶体粒子凝聚 能力的次序为：Al3+ > Fe3+> H+> Ca2+ > Mg2+ > K+ > Na+ > Li+。
常用的凝聚电解质有： 硫酸铝A12(SO4)3·18H2O (明 矾) 氯化铝AICl3·6H2O 三氯化铁FeCl3·6H2O 硫酸亚铁FeSO4·7H2O 石灰、ZnSO4、MgCO3等。
度，库仑/m2；
D：水的介电常数，F·m-1；
δ：扩散层的有效厚度，m（即吸附层和扩散层
界面处电位Φd降低到其值为1/e处的距离，不能直 接测定）
Qug2HgR 22ug
（2-2)
N：阿伏伽德罗常数，mol-1； e：电子电荷，库仑； k：波尔兹曼常数，J·K-1； T：热力学温度，K； ci：i离子摩尔浓度，mol/L； Zi：i离子的化合价。
将柠檬酸发酵液加热至80℃以上，使 蛋白质变性凝固和降低发酵液粘度，即可 大大提高过滤速率。
使蛋白质变性的其他方法有：大幅 度调节pH，加酒精、丙酮等有机溶剂或 表面活性剂等。
变性法存在一定的局限性。
加热法只适合于对热较稳定的目的产 物；极端pH也会导致某些目的产物失活， 并且要消耗大量酸碱；有机溶剂法通常只 适用于所处理的液体数量较少的场合。
应用现状：
目前最常用的絮凝剂是有机合成的聚 丙烯酰胺类衍生物，其絮凝体粗大，分离 效果好，絮凝速度快，用量少，适用范围 广。它们的主要缺点是存在一定的毒性， 特别是阳离子型聚丙烯酰胺，一般不宜用 于食品及医药工业。
近年来发展的聚丙烯酸类阴离子絮凝 剂，无毒，可用于食品和医药工业。
影响因素：
絮凝剂相对分子量和类型
加热法注意事项：
使用加热法时必须严格控制加热 温度与时间。
1. 加热的温度必须控制在不影响目的产物活 性变质的范围内；
2. 温度过高或时间过长，会使细胞溶解，胞 内物质外溢，增加发酵液的复杂性，影响 其后的产物分离与纯化。
二、调整pH
pH值直接影响发酵液中某些物质 的电离度和电荷性质，适当调节pH值 可改善其过滤特性。
一、高价无机离子的除去
发酵液中常见的无机离子主要有 Ca2+、Mg2+和Fe2+等。
钙离子的去除：
通常使用草酸
当发酵液中钙离子浓度较高时，可用 草酸的可溶性盐，如草酸钠。反应生成 的草酸钙还能促使蛋白质凝固，改善发 酵液的过滤性能。
由于草酸价格较贵，应注意采用适当 方法回收。
应用实例：
四环类抗生素发酵液常采用草酸钙 沉淀法除去钙离子，在其废液中加入硫 酸铅，在60℃下反应生成草酸铅，后者 在90－95℃下用硫酸分解，再经过滤、 冷却、结晶后即可回收草酸。
但是，这些正离子还具有因热运动而离开胶粒 表面的趋势。
双电层的组成
在相距胶核表面约一个离子半径Stern平面以内， 正离子被紧密束缚在胶核表面，称为吸附层；
在Stern平面以外，剩余的正离子在溶液中扩散 开去，距离越远，浓度越小，最后达到主体溶液的 平均浓度，称为扩散层。
当胶粒在溶液中作相对运动时，总有一薄层液 体，随着它一起滑移，这一薄层的厚度比吸附层 稍大，滑移面在图中用波纹线表示。
采用凝聚和絮凝技术能有效地除去杂蛋白 质和固体杂质，提高滤液质量。
1．凝聚
凝聚是指在电解质作用下，由于胶 粒之间双电层电排斥作用降低，电位下 降，而使胶体体系不稳定的现象。
在生理pH值下，发酵液中的菌体或蛋白质常 常带有负电荷，由于静电引力的作用，使溶液中 带相反电荷的阳离子被吸附在其周围，在界面上 形成双电层。
絮凝剂的加量 较多的絮凝剂有助于增加桥架的数量，
但过多的添加量反而会引起吸附饱和， 絮凝剂争夺胶粒而使絮凝团的粒径变 小，絮凝效果下降。
溶液的pH 溶液pH值的变化常会影响离子型
絮凝剂中官能团的电离度，从而 影响吸附作用的强弱。
搅拌转速和时间
3．混凝
对于带负电荷的菌体或蛋白质来说， 采用阳离子型高分子絮凝剂同时具有降 低胶粒双电层电位和产生吸附桥架的双 重机理。