指纹图谱

常见的中药指纹图谱的指标参数评判标准有直观标准法、量化数据对比法、计 算机图谱解析技术等，其中计算机图谱解析技术发展较为技术，解析的方法也比较 多，如模糊信息分析法、人工神经网络法、聚类分析法及化学计量学等。
直观对 比
用待测样品与标注图谱的特征直接比较，但这种方法不仅要求有标准图 谱，而且标准图谱库还要有足够的容量，要能涵盖大多的中药标准图谱。 即引入指数、重叠率、八强峰、表观丰度等量化数据进行比较。与直观 对比法进行相比，此法更客观、准确。但是，面临的问题就是如何建立 大量的标准数据库。
指纹特征
质量稳定性评价结果 方法学考察：重现性、稳定性、精密度
光谱法
光谱法主要包括红外光谱 (IR)、紫外光谱(UV) 和荧光光 谱(AFs)等3种方法。其中IR和UV是目前常用的2种用于中药指 纹图谱建立的方法。这2种方法对于成分简单的单昧药材具有 良好的鉴别效果，但由于其加和性，对于较为复杂的中药制剂 难以准确判断。
高效液相色谱工作流 程
高效液相色谱仪
核磁共振（NMR）指纹图谱
氢原子具有磁性，如电磁波照射氢原子核，它能通过共振吸收电磁波能量，发生 跃迁。用核磁共振仪可以记录到有关信号，处在不同环境中的氢原子因产生共振时吸 收电磁波的频率不同，在图谱上出现的位置也不同，各种氢原子的这种差异被称为化 学位移。利用化学位移，峰面积和积分值以及耦合常数等信息，进而推测其在碳骨架 上的位置。在核磁共振氢谱图中，特征峰的数目反映了有机分子中氢原子化学环境的 种类；不同特征峰的强度比（及特征峰的高度比）反映了不同化学环境氢原子的数目 比。 核磁共振氢谱（HNMR）指纹图谱鉴定中药有其独特的特点，它可以同时获得各类 质子化学的位移、数量、耦合关系等多个结构信息。 据此原理进行NMHR指纹图谱研究时首先要选择适当的提取分离工艺，制备其特征 总提取物，在NMHR波谱仪上测定中药的NMHR指纹图；对特征总提取物进行进一步分离， 得到单体化合物后，通过鉴定和NMHR研究，对指纹图谱图中的各个特征谱线进行归属。 从而实现核磁共振指纹图谱进行中药质量控制。
中药饮片指纹图谱
中成药指纹图谱
初级中药指纹图谱即常见的中药质量控制方法，是以保证中药的品
质为目的。重点是测定方法的建立、有效成分和控制指标的确定
高 中药药理 药效 级 阶 药动 段 生物等效性
高级阶段的指纹图谱研究多采用多仪器连用，如GC-MS（气象色谱-质谱连用）、
LC-MS（液相色谱-质谱联用）等方式，获取多维信息数据，寻找最佳药效相关指纹图谱， 指导实践，从而保证药品最终品质
核磁共 振仪
X射线衍射指纹图谱
X射线的波长和晶体内部原子面之间的间距相近，晶 体可以作为X射线的空间衍射光栅，即一束X射线照射到 物体上时，受到物体中原子的散射，每个原子都产生散 射波，这些波互相干涉，结果就产生衍射。物质组成， 晶型、分子内成键方式、分子的构型等决定该物质特有 的衍生图谱。 对中药而言，其组成成分是固定的某些化合物，当 收到X射线照射后产生的图谱是各混合物各组分衍射效应 的叠加。药材质量的稳定，其衍射图谱可以作为该混合 物的特征图谱。
构建方法
中药生物指纹图谱
中药生物指纹图谱包括中 药基因组学指纹图谱中药 蛋白质组学指纹图谱和中 药材DNA指纹图谱
构建指纹图谱的主要步骤
样品采集
方法建立
数据分析
样品评价
方法检验
中药样品处理
指纹图谱构建程序
预处理（提取分离）
测试样品
色谱分析
色谱图
对应关系 计算机图谱解析、处理
构效
指纹图谱
质量稳定性评价
紫外光谱法（UV）
紫外光谱法，是测定物质分子在紫外光区吸收 光谱的分析方法。紫外吸收光谱是物质吸收紫外光 后，其价电子从低能级向高能级跃迁，产生吸收峰 形成的。并非所有的有机物质在紫外光区都有吸收， 只有那些具有共轭双键（π 键）的化合物，其π 电 子易于被激发发生跃迁，在紫外光区形成特征性的 吸收峰。
4.对照品溶液的制备 选择甘草苷对照品作为参照物。精密称取甘草苷对照品5．0 mg置于25 ml量瓶中，加甲醇超声溶 解，制成0．2 mg/ml的对照品溶液，即得参照物溶液。精密称取甘草酸对照品2．5 mg置于25
ml量瓶中，加甲醇超声溶解，制成0．1 mg/ml的对照品溶液。
5.测定方法 精密度试验、重复性试验、稳定性试验 6指纹图谱及各项技术参数 6.1共有指纹峰的标定
荧光光谱分析法 （AFS）
AFS的基本原理是蒸汽状态的原子因吸收能量而跃迁至高能态，并在这个过程 中发射出具有固定波长的荧光。
中草药因大多含有发光性组分而具有特征的荧光光谱。因此可利用发光标记、 被测物本身发光性质、分子组装、能量转移原理等分离鉴定药物有效成分。如中药 材的荧光鉴定、中药注射液等的药物鉴别、以及荧光分析及其连用技术用于测定中 药有效成分。
毛细管电泳仪及色谱图
HPLC高效液相色谱法
HPLC高效液相色谱法是在经典液相色谱的基础上发展而成的。HPLC利用了气相色谱的理论和 方法。其工作原理是依据中药中各成分在展开剂和固定相之间分配系数的不同进行分离。HPLC受样 品本身和外界干扰的影响较小，非常适合用于中药指纹图谱的构建。HPLC具有仪器化程度高、分析 速度快、色谱柱可反复使用等优点，目前已成为指纹图谱研究的主要方法，应用十分广泛。 高效液相色谱法有“三高一广一快”的特点：
色谱法
目前用于构建中药指纹图谱的色谱法主要有薄层色谱 法 (TLC) 、高效液相色谱法 (HPLC) 、气相色谱法 (GC) 、 高效毛细管电泳法(HPCE)和高速逆流色谱指纹图谱法 (HSCCC)等
薄层色谱法(TLC)
TLC是利用中药成分性质上的差异经过薄层分离后相对位移值的不同进行鉴别的 一种方法。该方法具有操作简单，分析速度快，成本低等优点，适用于不同种类药 材指纹图谱的构建。使用该方法只需要选取好薄层色谱展开剂，分离样品后即可获 得直观的图谱图像。但是由于薄层板质量的差异和色谱系统的开放性等外界因素的 影响，导致薄层色谱法的精确性和重现性比较差．所以现在薄层色谱法的应用较少
中药指纹图谱构建及 质量评价技术
姓名：曹瑞致 学号：2015051655 专业：中药学
中药指纹图谱的构建 中药指纹图谱的活性标识 中药指纹图谱的评价技术
中药指纹图谱研究中的关 键问题
制定特征中药指纹是质量控制的有效途径，是保证中药安全有效的中药环节
中药指纹图谱制定的两个步骤
初 级 阶 段
中药材指纹图谱 提取物指纹图谱
主要用于化合物结构的鉴定和含量的测定。由 于中药所含成分的不饱和度是有区别的，其紫外吸 收曲线形状、峰位、峰强均有所不同，因此可以用 来鉴别药材。但紫外光谱是电子光谱，形状变化不 大，有时不同的化合物有相似的图谱，专属性差。 故紫外光谱较少的应用于指纹图谱。
苯的紫外光谱
红外光谱法（IR）
在有机物分子中，组成化学键或官能团的原子 处于不断振动的状态，其振动频率与红外光的振动 频率相当。所以，用红外光照射有机物分子时，分 子中的化学键或官能团可发生振动吸收，不同的化 学键或官能团吸收频率不同，在红外光谱上将处于 不同位置，从而可获得分子中含有何种化学键或官 能团的信息。 对单一组分或混合物中各组分也可以进行定量 分析，尤其是对一些较难分离并在紫外区、可见区 找不到明显特征峰的样品，可以方便、迅速的完成 定量分析。 红外光谱的优点：1.指纹性 2.对样品的要求 较低 3.可操作性较强 红外光谱在中药质量控制方面的应用： 1.中药材质量的监控 2.中药材生产过程质量的监控 3.中成药质量的监控
量化数据 对比
模糊信息分析法
1. 特征提取 2. 依照某种方式确定该中药指纹特征对“真 模式、假模式”的隶属度 3. 用最大从属原则或阀值原则确定中药的真 伪
计算机图谱解析技术
人工神经网络法
模拟人脑功能的全新信息处理方法，其理论 是神经网络的数学模型
聚类分析法
是利用在多维空间的相对位置，将样本分为 两个或多个集团的算法，属于无人管理分类
6.2共有指纹峰面积的比值
6.3相似度计算
对于中药复杂体系及多靶点的作用而言，指纹图谱比单一指标成分更能从整体上 反映该产物的药效质量。目前所谓的构效图谱，只不过是“活性提取物”的色谱 指纹图谱。能否在研究天然产物有机化学成分指纹图谱的同时，获得这些有机活 物质的活性作用通路，并同时发现活性先导化合物，构建“有机成分活性指纹图 谱”，就需要发展中药指纹图谱的活性标识技术。
。
高效薄层色谱法是指利用特殊材质的薄层板和展开技术来提高薄层色谱的灵敏 度和准确度，从而有效提高构建指纹图谱的效率。
薄层板
毛细管电泳（CE）
是色谱与电泳结合发展的产物。又称高效毛细管电泳（ high performance capillary electrophoresis HPCE），是一类以毛细管为分离通道、以高压直流电 场为驱动力的新型液相分离技术。高效毛细电泳法的工作原理是利用高压直流电场 推动中药样品在毛细管中运动，由于样品中各组分的淌度和分配行为的不同，导致 不同组分在毛细管中产生运动上的差异，从而实现分离的一种技术。 优点是分离效率高、快速、适用面宽，模式多样且易于变换，运行费用低，无环境 污染。特别适用于成分复杂的中药材和带电离子的分析。将其运用于中药的指纹图 谱的研究，已取得可观的成绩。但利用电泳机制在毛细管中进行分离使得该方法的 精确性和灵敏度较低，所以目前的使用并不是很广泛。
Fra Baidu bibliotek
质 谱 法（MS）
质谱分析是一种测量离子质荷比（质量-电荷比）的分析方法，其基本 原理是使试样各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子， 经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利 用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而 确定其质量。 中药各成分分子在质谱仪中被裂解为不同的碎片，其成分不同则其图谱 显示的碎片峰也不同，因而可以鉴别化学成分。MS一般都和色谱仪连用，常 见的有GC-MS、HPLC-MS、HPLC-UV-MS、LC-MS、HPLC-MS。
甘草HPLC指纹图谱研究
1.仪器药品
Agilentl200高效液相色谱仪：四元泵，在线脱气，手动进样，紫外检测器，Agilent化学工作站，柱温箱，CX250超声波清洗器(250 W，40 Hz，北京医疗设备二厂)，BT25S电子分析天平。 甲醇(色谱纯)，冰醋酸(分析纯)，重蒸馏水。甘草苷对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111610-200604)， 甘草酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号：111715-200420)；甘草药材(10批)均为市售
2.色谱条件
色谱柱：Apollo C8(250 mm×4.6 mm，5µL)；流动相：A甲醇，B 0.5％冰醋酸，梯度洗脱；流速：1.0 ml/min；柱温：30℃；检测波长：254 nm；进样量：5µL。
3.试品溶液的制备
取甘草药材粉末(过60目筛)约0．5 g，置于10ml量瓶中，加入适量甲醇超声提取(250 W，40 Hz)30min， 放冷加甲醇定容至10ml，摇匀，静止，取上清液经0．45斗m微孑L膜过滤，即得。
中药起药效的是有效物质群在发挥作用，不同的配伍将引起有效物质群 的该变。这种群体的变化可通过指纹图谱这种形式反映或表现出来。控 制好指纹图谱就可以获得良好的药效、稳定的质量和最佳的生物利用度。
中药指纹图谱的构建原则：
构建原则
系统性
特征性
稳定性
可操作性
中药指纹图谱的构建方法
中药化学指纹图谱
中药化学指纹图谱系指 采用光谱、色谱和其他 分析方法建立以表征中 药化学成分特征的指纹 图谱 光谱指纹图谱构建最常 用的是红外光谱（ IR ） 色谱最 常 用的是 TLC 、 GC、HPLC和CE
〈1〉高压：流动相为液体，流经色谱柱时，受到的阻力较大，为了能迅速通过色谱柱，必须对载 液加高压。 〈2〉高效：分离效能高。可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果，比工业精馏塔和气相色谱 的分离效能高出许多倍。 〈3〉高灵敏度：紫外检测器可达0.01ng，进样量在µL数量级。 〈4〉应用范围广：百分之七十以上的有机化合物可用高效液相色谱分析，特别是高沸点、大分子、 强极性、热稳定性差化合物的分离分析，显示出优势。