利用二代测序技术检出成人型多囊肾PKD1基因新突变

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区域的补充，实现对ＰＫｌ）Ｉ的全部编码外显子区域全覆盖测序分析，简化了ＰＫＤｌ
基因的基因诊断程序。另外，通过存储的频率信息可以进一步评估其致病可能， 节省了后期对于新发突变在群体发生频率的验证工作。在患者中检出一致病突 变，可作为其生育时产前基因诊断的依据。本研究检出的新的突变类型补充了 ＰＫＤｌ基因突变数据库。
Ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｎｇ ｖ．２，
ｈｔｔｐ：／／ｇｅｎｅｔｉｃｓ．ｂｗｈ．ｈａｒｖａｒｄ．ｅｄｕ／ｐｐｈ２）对Ｐ．Ｇｌｙｌ３ １９Ａｒｇ致病性进行预测，结果均判 定为有害突变。以上证据均支持Ｐ．Ｇｌｙｌ３１９Ａｒｇ为致病突变。在另一位患者的外显 子１５区域检出一杂合碱基改变ｃ．５８４７Ｃ＞Ｔ，为１９４９位Ｓｅｒ同义突变 （ｐ．Ｓｅｒｌ９４９Ｓｅｒ），文献已报道为无致病性的ＳＮＰ（ｒｓ８０１ １ １６６５），二代测序数据统计 学分析也排除了其致病性。为了避免可能出现的漏检，我们对测序深度＜８的外 显子１、２和３区域建立Ｓａｎｇｅｒ测序的方法，仍然没有检出突变。 我们通过目标区域捕获二代测序技术并结合Ｓａｎｇｅｒ测序对少数读序低深度
（Ｎｉｍｂｌｅｇｅｎ ２．１ Ｍ）进行杂交，富集ＰＫＤｌ基因的全部编码区外显子及其邻接内
含子区域（外显子旁侧１００ｂｐ），最后利用ＨｉＳｅｑ２０００（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＵＳＡ） 测序系统进行测序， 对测序读取的９０ ｂｐ短序列使用ＢＷＡ（Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）软件包将过滤后的读序比对至ＮＣＢＩ数据库（Ｂｕｉｌｄ ３７）参考序列上，分 别使用ＳＯＡＰｓｎｐ矛ＮＧＡＴＫ Ｉｎｄｅｌ软件分别对单核苷酸多态性（ＳＮＰ）位点和小的插 入和缺失（Ｉｎｄｅｌ）进行数据分析。我们在一个女性患者ＰＫＤｌ基因的外显子１５
区域检出一杂合碱基改变ｃ．３９５５Ｇ＞Ａ，并用Ｓａｎｇｅ湖０序验证了该突变。患者父母
表型正常，无相同碱基改变，患者为新生突变。由于本突变未见文献报道，我们 进一步对突变的致病性进行了分析。ｃ．３９５５Ｇ＞Ａ造成蛋白质编码的１３１９位中性 的甘氨酸变成了碱性的精氨酸（ｐ．Ｇｌｙｌ３１９Ａｒｇ），有可能较大地影响蛋白质的空间 结构；１３１９位于重要的ＰＫＤ结构域，是蛋白质互作过程中可能的配体结合位点； 对４５５位正常无关个体相应区域测序未检出同样ＳＮＰ；在１０种哺乳动物中进行 了蛋白质保守性分析显示ｐ．Ｇｌｙｌ３１９位点高度保守。经ＳＩＦＴ在线预测工具 （ｈｔｔｐ：／／ｓｉｆｔ．ｊｃｖｉ．ｏｒｇ／）以及ＰｏｌｙＰｈｅｎ一２软件ｆＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
术通讯作者：宋畴（Ｅｍａｉｌ．＇ｓｏｎｇｆ－５５８固２６３．ｎｅｔ） 背景Ａｎｇｅｌｍａｎ综合征（Ａｎｇｅｌｍａｎ ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＡＳ）和Ｐｒａｄｅｒ—Ｗｉ １ｌ ｉ综合征
（Ｐｒａｄｅｒ—Ｗｉｌｌｉ
ｓｙｎｄｒｏｍｅ，ＰＷＳ）分别是由于１５ｑ１１．２－ｑ１３区内母源或父源等位
基因印记异常所致的多系统复杂性遗传病，两者发病率均约为１／１，５０００。两种 疾病的遗传机制较类似，而临床特点各不相同。１５ｑ１１．２－ｑ１３区的缺失、单亲二 倍体（ｕｎｉｐａｒｅｎｔａｌ ｄｉｓｏｍｙ，ＵＰＤ）以及印记缺陷是两者的遗传学发病机制，区 别仅在于发生在父源或母源区域。另外，ＡＳ还可由位于母源１５ｑ１１．２－ｑ１３区的
泛素连接酶３Ａ基因（删）突变直接所致。目的通过对临床诊断或疑似的
ＡＳ／ＰＷＳ患儿进行遗传学分析，使患儿获得基因诊断、了解两种疾病的遗传缺陷 类型分布以及临床特点。方法（１）按照ＡＳ和ＰＷＳ临床诊断评分标准入选临床诊断 或疑似的９１例ＡＳ患儿和６０例ＰＷＳ患儿。（２）采用甲基化特异性ＰＣＲ（ＭＳ—ＰＣＲ）、 短串联重复序列（ＳＴＲ）连锁分析、ＬＩＢＥ３Ａ基因序列分析（仅针对Ａｓ疑似病例） 技术和染色体核型分析同时进行ＡＳ和ＰＷＳ的基因诊断和遗传机制分析。（３）在遗 传学检测的同时，进行相关内容的问卷调查。结果（１）所有Ａｓ和ＰＷＳ病例均为散 发病例，父母非近亲婚配。（２）４８例患儿明确诊断为ＡＳ，占入组病例的５２．７％ （４８／９１）。其中４０例为１５ｑ１１．２—１３区域的母源缺失（８３．３％，４０／４８），２例为 父源单亲二倍体型（４．２％），２例为印记缺损型（４．２％），２例发生了Ｌ猩Ｅ３Ａ基因 突变（４．２％）：Ｐｒ０４００ＨｉＳ和Ａｓｐ５６３Ｇｌｙ。有２例患儿父母未提供ＤＮＡ样品，未进 行遗传机制分型。对资料完善的３５例ＡＳ阳性患儿进行临床分析，结果显示男性、 女性患儿分别为１６例和１９例，年龄范围８月＂－－＇６岁３月，平均诊断年龄２７．８ 月。患儿平均竖头、独坐和独走年龄分别为５．５、１１．６和３３．８月。出生时身长、 体重及头围均在正常参考值范围。就诊时，所有的患儿均可观察到精神运动发育 迟缓、语言障碍、运动或平衡障碍和快乐表情等表现，近９０％患儿出现癫痫和特 征性脑电图（典型棘波、慢波），仅约３０％患儿存在小头畸形，２０％－－８０％患儿存 在ＡＳ的相关性表现或体征，尤以平枕或枕骨凹陷、宽嘴，宽牙缝等较突出。（３） 获得基因诊断的ＰＷＳ阳性患儿共２２例，占入组病例的３６．７％（２２／６０）：１５例为 １５ｑ１１．２—１３区域的母源缺失（６８．２％，１５／２２），５例为父源单亲二倍体型（２２．７％），
２．３５
Ａｎｇｅｌｍａｎ／Ｐｒａｄｅｒ—Ｗｉｌｌｉ综合征的基因诊断和临床分析
首都儿科研究所遗传研究室（１０００２０）白晋丽瞿宇晋宋叻 首都儿科研究所附属儿童医院（１０００２０）王立文陈晓波 解放军总医院儿科中心（１００８５３）邹丽萍 北京大学第一医院儿科（１０００３４）杨艳玲 首都医科大学附属北京儿童医院神经科（１０００４５）杨欣英
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利用二代测序技术检出成人型多囊肾ＰＩ（Ｄ１基因新突变
杨涛１，孟岩１，张明荣２，王炜辰１，魏晓明２，黄尚志１
２．
中国医学科学院基础医学研究所，北京协和医学院基础学院 ３．深圳华大基因研究院
常染色体显性遗传性多囊肾病ｆ
Baidu Nhomakorabea
ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｄｏｍｉｎａｎｔ ｐｏｌｙｃｙｓｔｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ．
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ＡＤＰＫＤ）是最常见的遗传性肾脏病，其发病率为１／４００．１／１０００，在终末期肾功能 衰竭患者中占５－８％。该病以双侧肾脏发生多个囊肿且进行性增大为特征，约５０％ 的患者最终可发展为肾功能衰竭。其遗传病因源于ＰＫＤｌ或ＰＫＤ２基因的突变。 通常由ＰＫＤｌ基因突变所致的ＡＤＰＫＤ患者的临床症状较重，发生肾功能衰竭的 年龄较早。在ＡＤＰＫＤ家系中，ＰＫＤｌ突变占８５％，ＰＫＤ２突变占１５％。ＰＫＤｌ 基因包含１２９０６ｂｐ的编码区，含４６个外显子。以往多采用逐个外显子区域ＰＣＲ 扩增Ｓａｎｇｅｒ测序的方法，非常繁琐。另一方面，上游的３３个外显子区域在１６ 号染色体上有多个同源重复，部分区域的重复次数可高达１４次以上，这也给 ＰＫＤｌ基因的突变检测造成很大的难度。因此，建立更为高效准确的ＰＫＤｌ基因 突变检测方法尤为重要。近年来出现的目标基因捕获和新一代测序技术有可能为 ＰＫＤｌ基因突变检测带来技术上的突破。 我们和深圳华大基因研究院合作，利用该项技术对在ＰＫＤ２基因中未检测出 致病突变的两个ＡＤＰＫＤ患者进行了ＰＫＤｌ基因测序研究。血液中提取的基因组 ＤＮＡ经ＣｏｖａｒｉＳ Ｓ２超声打断仪将ＤＮＡ打断至２００、３００ｂｐ后，连接特异性标签序列， 按照１１ｌｕｍｉｎａ公司提供的标准建库流程进行文库制备。制备的文库与捕获芯片