微生物限度检查方法适用性试验方案

微生物限度检查方法适用性试验报告

品名：黄连上清片

批号：20160101

******药业有限责任公司

1.概述

微生物限度检查法系检查非规定灭菌制剂及其原料、辅料受微生物污染程度的方法。检查项目包括需氧菌总数、霉菌数和酵母菌总数及控制菌检查。当建立产品的微生物限度检查法时，应进行需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法的适用性试验和控制菌检查方法的适用性试验，以确认所采用的方法适合于该产品的需氧菌、霉菌和酵母菌数的测定和控制菌检查。

我公司生产的品种黄连上清片由于依照《中国药典》2010版的检查方法验证，细菌、霉菌和酵母菌、控制菌检查均采用平皿法。故现升级为《中国药典》2015版，需氧菌、霉菌和酵母菌及控制菌拟采用平皿法重新进行方法适用性试验，以确认平皿法仍然适用于该品种的微生物限度检查。

2.验证内容

2.1培养基确认

经检查，上述培养基来源于北京奥博星科技有限公司，是我公司审计的合格供应商，并经过培养基适用性实验检查合格，可以使用。

确认人：确认日期：

2.2检查用培养基配制方法

上述培养基按照规定的方法配制、灭菌后可以使用。

确认人：确认日期：

2.3使用设备

上述设备经过校准合格，设备状态良好，可以使用。

确认人: 确认日期： 2.4实验用菌株

上述传代后待使用的菌种在5代之内，菌种特征明显，无变异，可以使用。

确认人：确认日期：

2.5试验方法

2.5.1供试品制备

取供试品 10g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml→1:10供试液，该供试液可以用于需氧菌、霉菌和酵母菌、控制菌的检查。

2.5.2菌液的制备

2.5.2.1取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨琼脂斜面培养物一铂金饵，加入胰酪大豆胨液体培养基中置30～35℃培养箱中培养18～24h，取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的胰酪大豆胨液体培养物1ml加入PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，分取各菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用。

2.5.2.2取白色念珠菌的沙氏葡萄糖琼脂斜面培养物，加入沙氏葡萄糖液体培养基中置20～25℃培养箱中培养2～3天，取白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养物1ml加入9mlPH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，制成10-1 的菌液，依法10倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml的菌液备用。

2.5.2.3取黑曲霉的新鲜培养物接种沙氏葡萄糖琼脂斜面上，20-25℃培养5-7天，加入3-5ml含0.05%聚山梨酯80的PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液中，将孢子洗脱。取1ml加入含0.05%聚山梨酯80的9ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，制成10-1的菌液，依法10倍稀释至10～7，取菌悬液1ml注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基25ml，各菌悬液平行制备两个平皿，平皿法培养计数，取小于100CFU/ml菌液备用。

2.5.3菌落计数

2.5.

3.1分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌与枯草芽孢杆菌菌液各1ml接种至胰酪大豆胨琼脂培养基中（每种菌液接种2个平皿），置30～35℃培养不超过3天；

2.5.

3.2分别取白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中（每种菌液接种2个平皿），置30～35℃培养，不超过5天。

2.5.

3.3菌落计数结果见下表（2个平皿计数取平均值）

菌落计数结果（cfu∕ml）

2.5.4需氧菌、霉菌和酵母菌计数方法适用性试验

2.5.4.1供试液制备

取供试品10g加PH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，混匀，做为供试液。

2.5.4.2实验条件

2.5.4.2.1需氧菌培养温度：30～35℃ 3～5天。

2.5.4.2.2霉菌和酵母菌培养温度：20～25℃ 5～7天。

2.5.4.3试验方法

2.5.4.

3.1试验组（供试液+菌液+培养基）

a.分别取3份供试液各10ml，分别加入0.1ml不大于100CFU的铜绿假单胞菌液、金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液，混匀后取其中1ml注皿，倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，置30～35℃培养箱中培养不超过3天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。

b.分别取2份供试液各10ml，分别加入0.1ml浓度不大于100CFU白色念珠菌液、黑曲霉菌液，混匀后分别取其中1ml注皿,倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基约20ml，置30～35℃培养箱中培养不超过5天，计数，每株试验菌平行制备2个平皿。

2.5.4.

3.2供试品对照组（供试液+稀释液+培养基）

取供试液4ml，分别注入4个无菌平皿中（每皿1ml）；将其分成2组，分别加入0.1mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液，混匀后一组倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，另一组倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，置与试验组相同条件下培养, 计数。

2.5.4.

3.3菌液对照组（稀释液+菌液+培养基）

分别取5份稀释液各10ml，分别加入0.1ml浓度不大于100CFU的5种菌液，混匀后每份取2 ml分别注2个无菌平皿（每皿1 ml）中，倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基（铜绿假单胞菌液、金黄色葡萄球菌液、枯草芽孢杆菌液注入胰酪大豆胨琼脂培养基）和沙氏葡萄糖琼脂培养基（白色念珠菌液、黑曲霉菌液注入沙氏葡萄糖琼脂培养基），置与试验组相同条件下培养, 计数。每株试验菌平行制备2个平皿。

2.5.4.

3.4阴性对照组（稀释液+培养基）

另分别取2份各1mlPH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液注入平皿, 倾注温度不超过45℃的胰酪大豆胨琼脂培养基，置30～35℃培养箱中培养不超过3天。倾注温度不超过45℃的沙氏葡萄糖琼脂培养基约20ml，置30～35℃培养箱中培养不超过5天。

2.5.4.4结果判定依据

2.5.4.4.1 阴性对照组应无菌生长，进行下一项计算。否则实验失败，不允许进行下一项判定。

2.5.4.4.2 试验组的菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。

比值=试验组菌落数-供试品对照组的菌落数

菌液对照组菌落数

2.5.4.5试验结果

2.5.4.5.1阴性对照组结果：无菌生长。

2.5.4.5.2需氧菌总数计数结果

品名：黄连上清片批号:

结果判定: 需氧菌总数计数实验阴性对照无菌生长，该实验有效； 5种菌的试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内，符合药典要求。

检验人：日期：复核人：日期：