甘油管冷冻保藏方法收集

§菌种管由传统的玻璃菌种管改为0.5ml带盖塑料离心管。

方法：

①将塑料离心管置耐高压塑料离心管盒内并用双层报纸包好，高压蒸汽15磅15min消毒，放烤箱80℃烤干。

②在净化工作台内将脱脂牛奶洗下的浓厚菌悬液用长毛细玻璃滴管加到塑料离心管的底部，每只0.2ml左右，切记不要将牛奶污染离心管口。

③将加好菌液的离心管盒置-20℃冰箱预冻，预冻好后把离心管盒放置到冷冻干燥机干燥箱内冻干。

④冻干后在净化工作台内压好离心管盖，不抽真空。贴标签，用封口膜封离心管口。放-20℃冰箱保存。

§该改良法优点有：

⑴操作过程大大简化，菌种管口不需溶封，不抽真空。

⑵菌种管抗破损性极佳；

⑶菌种管体积超小。⑷成本低廉，易于商品化生产、推广。

笔者使用该改良法近七年，本省发放菌种上万只没有破损情况出现；数次发放嗜血杆菌、链球菌、奈瑟氏菌等苛养菌，生长情况良好。近几年我们还向华东地区部分兄弟省分提供了室间质评菌种四万余只，效果满意。

实验——微生物菌种常规保藏方法

录入时间:2011-4-13 9:30:37 来源：天津农学院精品课程

菌种是一种重要的生物资源，菌种保藏是重要的微生物基础工作。菌种保藏就是利用一切条件使菌种不死、

不衰、不变，以便于研究与应用。

1 目的

1.1 了解菌种保藏的基本原理

1.2 掌握几种常用的菌种保藏方法。

2 原理

菌种保藏的方法很多。其原理却大同小异，不外乎为优良菌株创造一个适合长期休眠的环境,即干燥、低温、缺乏氧气和养料等。使微生物的代谢活动处于最低的状态，但又不至于死亡，从而达到保藏的目的。依据不同的菌种或不同的需求，应该选用不同的保藏方法。一般情况下，斜面保藏、半固体穿刺,石蜡油封存和砂土管保藏法较为常用，也比较容易制作。

3 材料

3.1菌株

待保藏的适龄菌株斜面

3.2培养基

肉汤蛋白胨斜面，半固体及液体培养基。

3.3 试剂

10%HCl无水氯化钙、石蜡油、五氧化二磷。

3.4 器具

用于菌种保藏的小试管(10*100毫米)数支、5毫升无菌吸管、l毫升无菌吸管等、灭菌锅、真空泵、干燥器、冰箱无菌水、筛子(40目、120目)、标签、接种针、接种环、棉花、牛角匙等等。

4 流程

斜面保藏→半固体穿刺保藏→石蜡油封存→砂土管保藏

5 步骤

5.1斜面保藏

5.1.1流程

标记试管→接种→培养→保藏

5.1.2步骤

5.1.2.1贴标签

取无菌的肉汤蛋白胨斜面数支。在斜面的正上方距离试管口2-3厘米处贴上标签。在标签纸上写明接种的细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.1.2.2斜面接种

将待保藏的细菌用接种环以无菌操作在斜面上作划线接种。

5.1.2.3培养

置37恒温箱中培养48小时。

5.1.2.4保藏

斜面长好后，直接放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一船可保藏三个月至半年。

5.2半固体穿刺保藏

5.2.1流程

标记试管→穿刺接种→培养→保藏

5.2.2 步骤

5.2.2.1贴标签

取无菌的半固体肉汤蛋白等直立柱数支，贴上标签，注明细菌菌名、培养基名称和接种日期。

5.2.2.2穿刺接种

用接种针以无菌方式从待保藏的细菌斜面上挑取菌种，朝直立柱中央直刺至试管底部，然后又沿原线拉出。

5.2.2.3培养

置37恒温箱中培养48小时。

5.2.4保藏

半固体直立柱长好以后，放入4℃的冰箱中保藏。这种方法一般可保藏半年至一年。

5.3石蜡油封存

5.3.1流程

标记试管→接种→培养→加石蜡油→保藏

5.3.2 步骤

5.3.1标记

同5.1.2.1

5.3.2接种

同5.1.2.2

5.3.3培养

同5.1.2.3

5.3.4加石蜡油

无菌操作下将5毫升石蜡油到培养好的菌种上面，加入的量以超过斜面或直立柱1厘米高为宜。

5.3.5保藏：石蜡油封存以后，同样放入4℃冰箱中保存。也可直接放在低温干燥处保藏。这种方法保藏期一般为一至二年。

5.4砂土管保藏

5.4.1 流程

制沙土管→灭菌→制菌液→加样→干燥→保藏

5.4.2 步骤

5.4.2.1制作沙土管

选取过40目筛的黄砂，酸洗，再水洗至中性，烘干备用；过120目筛子的黄土备用；按1份土加4份砂的比例均匀混合后，装入小试管，装量1厘米左右。

5.4.2.2灭菌

加压蒸汽灭菌，直至检测无菌为止。

5.4.2.3制备菌液

取3毫升无菌水至待保藏的菌种斜面中，用接种环轻轻刮下菌苔。震荡制成菌悬液。

5.4.2.4加样

用1毫升吸管吸取上述悬液0.1毫升至砂土管，再用接种环拌匀。

5.4.2.5干燥

把装好菌液的砂土管放入干燥器或同时用真空泵连续抽气，使之干燥。

5.4.2.6保藏

干燥后的砂土管可直接放入冰箱中保藏；也可以用石蜡封住棉花塞后放冰箱中保藏。

（二）冷冻干燥保藏法

1目的

1.1理解冷冻干燥保藏菌种的原理

1.2掌握冷冻干燥保藏菌种的方法。

2 原理

冷冻干燥保藏菌种法可克服简单保藏方法的不足。利用有利于菌种保藏的—切因素，使微生物始终处于低温、干燥、缺氧的条件下，因而它是迄今为止最有效的菌种保藏法之一。

3 材料

3.1 菌株

待保藏的各种菌种。

3.2试剂

2% HCl；牛奶。

3.3器具

安瓿管、标签、长滴管、脱脂棉、干冰、离心机、冷冻真空装置、高频电火花器。

4 流程

备安瓿管→备脱脂乳→制菌悬液→分装→预冻→真空干燥→保藏→活化

5步骤

5.1准备安瓿管

安瓿管先用2%HCl浸泡，再水洗多次，烘干。将标签放入安培管内，管口塞上棉花，灭菌备用。

5.2制备脱脂乳

用鲜奶经处理或使用脱脂奶粉配兑脱脂牛奶，灭菌，并做无菌试验后备用。

5.3制菌悬液

将无菌牛奶直接加到待保藏的菌种斜面内，用接种环将菌种刮下，轻轻搅乱使其均匀地悬浮在牛奶内成悬浮液。

5.4分装

用无菌长滴管将悬浮液分装入安瓿管底部，每支安培管的装量约为0.9毫升。(一般装入量为安瓿管球部体积的1／3)