耐药结核病诊断新技术优秀课件

土地分枝杆菌 /
不产色分枝杆菌 /
苏加分枝杆菌 /
马儿摩分枝杆菌 /
蟾蜍分枝杆菌 /
胞内分枝杆菌 /
鸟分枝杆菌
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分枝杆菌属
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内控
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HEX / / / / / 81.0 76.0 71.0 66.5 58.0 / / / / / / / / / / /
耐药率高： 48万新发的MDR-TB病例和10万耐利福平结核病（RR-TB） 病例；
接受MDR检测、报告和治疗的MDR-TB不足1/3，接受治疗的MDR-TB 治愈成功率只有50%
2015年全球估计MDR-TB患者数
结核病快速及时诊断是结核病防控 重要因素
对新型耐药检测技术的要求
操作简便 检测时间短 闭管检测 检测位点全面
CC 质控点
非结核分枝杆菌
在国内4个省的4个地市级CDC进行了评估。
结核病和非结核的诊断
特点
标本：菌株、涂阳痰标本 时间：约8小时 优点：高通量 灵敏度、特异度高
国家结核病参比实验室推荐建议
基因芯片可以用于: 可疑耐药结核病患者筛查,它有望代替利福
平和异烟肼的传统药敏试验
可能使用层级: 地市和省级（医疗机构和疾病预防机构）
根据不同的ΔTm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变
根据不同的ΔTm值可以判断出异烟肼不同的碱基序列发生突变
链霉素
乙胺丁醇
氟喹诺酮
每个突变都表现出特有的谱线 对应独特的熔点, 软件可以自动地给出 突变类型,即使发生不均一突变的情况,也可以分辨出来.
操作流程
步骤一
自动提取1-24份样本
步骤二
v 96%利福平耐药突变发生在rpoB507-533共81bp区域内
根据靶序列熔点的变化，检测rpoB基因 是否含有突变，获得利福平耐药信息
根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
根据不同的ΔTm值可以判断出ropB可能不同的碱基发生突变
异烟肼耐药突变检测体系示意图
通过检测 katG315、inhA 启动子和、ahpC 启动子区、inhA94 、密码子的突变 与否确定样品对异烟肼的耐药性。
样品制备仪 杂交仪 激光共焦扫描仪 软件判读
基因芯片仪和试剂获国12 家SFDA和欧盟CE认证
基因芯片法
利福平的耐药位点
同时鉴定MTC与21种NTM
MSM 耻垢分枝杆菌 MIN 胞内分枝杆菌 MKA 堪萨斯分枝杆菌 MCH 龟分枝杆菌龟亚种 MMA 海/溃疡分枝杆菌 MFO 偶发/猪分枝杆菌 MTE 土分枝杆菌 MNO 不产色分枝杆菌
多数研究报告提示：耐药的发生与结核杆菌的基因突变有关。总体上是基因一个或几个核苷酸
突变（表现增加、缺失、替代），造成核苷酸编码错误致氨基酸错位排列，影响药物与靶位酶结合产 生耐药
抗结核药物 检测位点
突变覆盖率
利福平 异烟肼 乙胺丁醇
rpoB507~533 之间(81bp)内任意突变 ahpC 启动子区（-44 ~ -30 以及-15 ~ 3 位点）， inh94 密码子， inhA 启动子区（-17 ~ -8 位点）以及 katG315 密码子 embB306,368,378,380,406,497 密码子突变
加入1-96个提取样本到 检测管中
步骤三
集成多重PCR和结果自动报告
总耗时约3小时，手工操作时间约15分钟
（一）DNA提取
～40 min
高质量的样本DNA
样本类型：痰液、灌洗液、培养菌株…… • 快速高效，1小时内完成24份样本提取；
灵活可控，单次运行可处理1～24 份样本； 高度均一，整个提取过程均由仪器自动完成，保证了提取样本的均一性。
MTC 结核分枝杆菌复合群 MAV 鸟分枝杆菌 MSC 瘰疠分枝杆菌 MAB 龟分枝杆菌脓肿亚种 MXE 蟾蜍分枝杆菌 MGI 浅黄分枝杆菌 MPH 草分枝杆菌 MGO 戈登分枝杆菌
MTR 次要分枝杆菌 MGA 胃分枝杆菌 MUA 母牛分枝杆菌 MSZ 苏尔加分枝杆菌 MDI 迪氏分枝杆菌 MSI 猿猴分枝杆菌
灵敏准确
基因芯片技术
结核病耐药与基因
异烟肼
50-70% kat G基因突变 5-10% inh A基因突变 6-13% ahp C基因启动子区域突 变
利福平
95% rpo B基因突变
耐药 基因
70% 65% 93% 95%
链霉素
64-68% rps L 基因突变
乙胺丁醇
70% emb B基因突变
耐药结核病诊断新技术
• 主要内容
• 一、概述 • 二、基因芯片技术 • 三、熔解曲线技术
2016年全球结核病报告
全球范围内结核病疫情严重 患病率高： 新发患者1040万/年，其中有120万（11%）HIV患者；
死亡率高：每年死亡人数达140万（13.46%），HIV/TB:死亡人数40万 （33.33%）；
95% 70%-90% 75%-95%
链霉素
rpsL43, rpsL88, rrs513~517, rrs905~908 位点的突变
70%-90%
氟喹诺酮
gyrA88~94 内任意突变
70%-90%
注射类二线药
rrs 基因 1401、1402、1473、1484 位点以及 eis 基因启动子 区-37、-14、-13、-10 位点
阿米卡星>95% 卡那霉素>85% 卷曲霉素 70~80% 紫霉素<10%
基因芯片（原理）
基因芯片方法是基于结核杆菌的利福平和异烟肼耐药 性相关的rpoB/katG/inhA的基因位点发生突变，通过PCR 扩增、和固定于尼龙膜上的寡核苷酸探针进行杂交、扫描 ，检测荧光信号的有无，判断特定位点的突变情况和结核 菌耐药性。
（二）加入PCR反应管
（三）PCR过程和自动判读
Βιβλιοθήκη Baidu
菌种
Tm / ℃ FAM
耻垢分枝杆菌 83.0
牛分枝杆菌
62.5,75.5
瘰疬分枝杆菌 69.5
结核分枝杆菌 62.5
龟分枝杆菌
55.5
猿猴分枝杆菌 /
嗜血分枝杆菌 /
戈登分枝杆菌 /
堪萨斯分枝杆菌 /
脓肿分枝杆菌 /
偶然分枝杆菌 /
海/溃疡分枝杆菌 /
推荐理由: •在我国获得注册证书； •国内研究显示其敏感性和特异性较好； •民族品牌 •数据显示在我国具有可行性,符合成本效果；
探针熔解曲线技术
工作原理
在一定环境下，DNA双链在其长度和序列一定时，Tm值也一定， 当发生错配时，Tm值下降，下降的幅度与发生错配的碱基数目、类型和位置有关。
ΔTm
利福平耐药突变检测体系示意图