第十章 植物细胞、组织和器官超低温保存

4．降温冰冻方法 (1) 快速冰冻法：将材料从0℃，或者其他预处理 温度 (如木本植物的冬芽在-3℃一-10℃预处理20天) 直接投入液氮。其降温速度在每分钟l000℃以上。 植物体内的水分在降温冰冻过程中，从-10℃到140℃是冰晶形成和增长的危险温度区，在- 140℃以 下，冰晶不再增生。因此，快速冰冻法成功的关键 在于，利用超速冷冻，使细胞内的水分迅速通过冰 晶生长的危险温度区，即细胞内的水分还未来得及 形成冰晶中心，就降到了-196℃的安全温度，从而 避免了细胞内结冰的危险。
2. 花粉保存后活力及存活率的检测 (1)染色显示法：例如TTC的还原显示法和FDA荧光染 色法，借助染色反应，统计花粉保存后的活力及存活 率。也可采用MTT(甲基噻唑基四唑)及联苯胺染色法 鉴定。 (2)花粉的人工萌发：关键是花粉萌发培养基的配制。 迄今最成功采用的是Brewback和Kwack配制的培养 基．它使许多种植物的花粉获得良好的萌发。该培养 基的成分是：10％蔗糖， 100ppmH3BO3 (或100— 500ppm)， 300 ppmCa(N03)2.4H 20，200ppm MgSO4· 2O，100ppm KNO3，琼脂0.8％。将液化的 7H 培养基滴于清洁的载玻片上，铺成一薄层，冷却后洒 播适当密度的花粉，将载被片放于培养皿内，载片两 边放臵润湿的滤纸或棉球，盖好培养皿，臵于25— 30℃培养箱中培养1—2小时，然后放臵于显微镜下观 察，统计花粉的萌发率。
第十一章 植物细胞、组织及器官的超低温保存
一、超低温种质保存的发展历史：
1949年Polge发现甘油具有保存特性，标志着低 温生物学的形成；
1980年开始进行玻璃化保存，开展超低温保存 研究。 动物细胞、组织、胚胎---植物细胞、组织、器 官
二、超低温保存的作用及意义
1. 保持细胞培养物的遗传稳定性；
所谓冷冻保存，就是将体外培养物或生物活性材料悬 浮在加有或不加冷冻保护剂的溶液中，以一定的冷冻速率 降至零下某一温度（一般是低于-700C的超低温条件），并 在此温度下对其长期保存的过程。 而复苏就是以一定的复温速率将冻存的体外培养物或生 物活性材料恢复到常温的过程。不论是微生物、动物细胞、 植物细胞还是体外培养的器官都可以进行冻存，并在适当 条件下复苏。
(3)以1℃／分降温速度从0℃降到—35℃，停留2小时 后投入液氮中保存。
(4)从液氮罐中取出材料，立即用40℃温水浴快 进化冻。 (5)化冻后立即用原生质体培养液洗涤2次，随 即将原生质体转移到直径6cm的培养皿中进行浅 层液体培养．密度为1 x l04／ml，在昼温28℃／ 夜温24℃黑暗条件下培养。 (6)待培养皿中再生的愈伤组织长到1—2mm时， 转移到分化培养基上，温度22—25℃，光照9小 时。 与此同时，将未经冰冻处理的原生质体直 接培养作为对照．
4. 遗传性状的分析： 1)细胞全能性的保持：形态发生能力的表达 情况。 2)后代的形态特征及生长发育状况。 3)后代染色体的分析。 4)同工酶谱的分析。 5)特殊产物的分析。 6)抗逆性的分析。
七、愈伤组织及悬浮培养细胞的超低温保存 1. 已进行超低温保存的植物：
目前已超过30种植物成功进行了愈伤组织 及悬浮细胞超低温保存。保存后的材料表现 出较高的存活率。
2. 长期保存植物的种质资源;
3. 长期保存农作物的优良品种及其育种亲本 材料的种质； 4. 建立长期保存的茎尖分生组织种质库及无 病毒的原种；
5 . 保存实验材料，防止再培养中遗传变异。
三、超低温保存的原理及理论依据
在低于-700C的超低温条件下，有机体细胞内部的生化 反应极其缓慢，甚至终止。因此采取适当的方法将生物材 料降至超低温，即可使生命活动固定在某一阶段而不衰老 死亡。当以适当的方法将冻存的生物材料恢复至常温时， 其内部的生化反应可恢复正常。
(3)两步冰冻法：这种方法是慢冻法和快 冻法的结合，或者说，是一种改良的慢冻法。 第一步是用慢速降温法从0℃降到一定的预冻 温度，使细胞达到适当的保护性脱水； 第二 步，投入液氮中迅速冰冻。
(4)逐级冰冻法：此方法是制备不同等级温度 的冰浴，如—10℃，—15℃，—23℃，—35℃， 或—40℃等。保存材料经冰冻保护剂在0℃预 处理后，逐步通过这些温度，样品在每级温度 上停留一定时间(4—6分钟)，然后浸入液氮。
2．组织和细胞超低温保存实验程序
(1)将培养5一7天的悬浮培养细胞，或培养10一15天的 愈伤组织收集于保存试管中，每管0.5-1.0ml。
(2)将盛有材料的试管插入冰浴中，待温度平衡后，加 入0℃预冷的冰冻保护剂(10％DMSO +0.5 mo1／L 山梨 糖醇)，使保护剂稍淹过保存材料。在0℃放臵30分钟。 (3)以1℃／分的降温速度从0℃降到-10℃，轻轻摇动试 管，使试管内的溶液结冰。停留15－20分钟。然后以同 样降温进度降到-30℃－-40℃，停留2小时，然后浸入液 氮中。
当温度进一步下降，细胞内外都结冰，产生冰晶 损伤。但是如果在溶液中加入冷冻保护剂，则可保护 细胞免受溶质损伤和冰晶损伤。因为冷冻保护剂容易 同溶液中的水分子结合，从而降低冰点，减少冰晶的 形成，并且通过其摩尔浓度降低未结冰溶液中电解质 的浓度，使细胞免受溶质损伤，细胞得以在超低温条 件下保存。
在复苏时，一般以很快的速度升温，1-2分钟内即恢 复到常温，细胞内外不会重新形成较大的冰晶，也不会 暴露在高浓度的电解质溶液中过长的时间，从而无冰晶 损伤和溶质损伤产生，冻存的细胞经复苏后仍保持其正 常的结构和功能。冷冻保护剂对细胞的冷冻保护效果还 与冷冻速率、冷冻温度和复温速率有关。而且不同的冷 冻保护剂其冷冻保护效果也不一样。
水在低于零度的条件下会结冰。如果将细胞悬浮在纯水 中，随着温度的降低，细胞内外的水分都会结冰，所形成 的冰晶会造成细胞膜和细胞器的破坏而引起细胞死亡。这 种因细胞内部结冰而导致的细胞损伤称为细胞内冰晶损伤。
如果将细胞悬浮在溶液中，随着温度的降低，细胞外部 的水分会首先结冰，从而使得未结冰的溶液中电解质浓度 升高。如果将细胞暴露在这样高溶质的溶液中且时间过长， 细胞膜上脂质分子会受到损坏，细胞便发生渗漏，在复温 时，大量水分会因此进入细胞内，造成细胞死亡。这种因 保存溶液中溶质浓度升高而导致的细胞损伤称为溶质损伤 或称溶液损伤。
-196℃(液氮）
(6) 保存后的化冻：一般在37—40 ℃温水浴中 快速化冻。
(7) 活力测定, 通常采用TTC法(氯化三苯四氮唑 还原法)。如果是单细胞或原生质体，可采用活 性荧光素染色法，显示活细胞，统计存活率。 (8) 再培养，观察组织细胞恢复生长的速度、 存活率、植株的再生能力。 (9) 遗传性状的分析：如植株的形态特征、生 长发育状况、染色体、同工酶及抗逆性等。
九、花粉的超低温保存
1．花粉保存的目的与意义 (1)延长花粉寿命．解决花期不遇和异地植物杂交上的困 难；对于木本植物还具有加快育种速度的作用，因为从它 们种子的实生苗到开花，需要几年、十几年的时间。 (2)花粉的贮存也是种质保存(基因保存)的一种有效而经 济方式，特别是对森林、果树和观赏植物具有实际意义 (3)花粉种质库的建立，不仅便于地区和国际间的种质交 换。而且可将病原体的传播和扩散降低到最低限度，因为 花粉一般不带病毒，也不与真菌孢子混合。 (4)花粉的超低温保存还可为花粉培养的细胞工程和基因 工程，以及花粉的生理生化研究随时提供稳定的试验材料。
6．光照对恢复生长的影响
黑暗条件下有利于超低温保存培养物 的恢复生长。
六、超低温保存后细胞活力、存活率及遗传特性 的观测 1. 显示细跑活力的TTC法(氯化三苯四氮唑还原 法) ，反映脱氢酶活力。 2．显示细胞存活率的二醋酸酯荧光素(FDA)染 色法，反映酯酶的脱脂化作用，或采用中性 红染色法。 3. 再培养 新鲜培养基上培养。存在停滞期。
2 . 基本程序 (1) 材料的准备与选择。 (2) 预处理。 (3) 将材料装入试管，并随即插入冰浴中。 (4) 加入0℃预冷的冰保护剂，在0℃(冰浴中)放臵30一 45分钟。
(5) 降温冰冻：
a 直接投入液氮；
b 程序慢速(0. 5- 5 ℃／分)降温到液氮；
c 慢速降温到预冻温度 (-30 - 0℃)，停留一段时间(1-3小时) 后投入液氮， d 逐级降温后投入液氮， 如：0 －-10℃，5分； -15 ℃, 5分； -23℃, 5分；-30℃，5分；-40℃，5分；
(2)慢速冰冻法：通常成熟的植物细胞都具有大 的液泡，含有大量水分。对大多数植物材料说来， 不适宜采用快速冰冻法，而需要在冰冻保护剂存在 的条件下，采用慢速冰冻法。以每分钟0. 1-10℃的 降温速度(一般1—2℃／分较好)。降到—70℃左右， 随即浸入液氮，或者以此种速度连续降到一196℃。 在这种降温速度下，可以使细胞内的水分有充足的 时间不断流到细胞外结冰，从而使细胞内的水分减 少到最低限度，达到良好的脱水效应，避免细胞内 结冰。
(4)在液氮中贮存一定时期后，取出材料在37—40℃温水 浴迅速化冻，化冻后立即转移到20℃水浴中。
(5)化冻后，用含3％蔗糖的液体培养基洗涤3次，为减 轻和避免渗透冲击的伤害，培养液应逐步加入。 (6)洗涤后立即转移到新鲜培养基上进行再培养：或者 不经洗涤，直接转移到半固体培养基上，或漂浮于液体 培养基的滤纸上培养。先臵于黑暗条件下培养15—30天， 然后转移到光照下培养。 (7)待恢复生长后，统计存活率。此外，在化冻洗涤后， 可采TTC法和FDA荧光染色法观测细胞的活力和存活率。
3．冰冻保护剂 迄今，已经报道了多种类型的冰冻保护剂。 常用的是二甲基亚砜(DMSO)、甘油、糖和 糖醇类物质、氨基酸、多肽及聚乙二醇等。 但作为冰冻保护剂的物质应该具备以下特性： （1）易溶于水； （2）在适当浓度下对细胞无毒；
（3）化冻后容易从组织细胞中去除。
冷冻保护剂的作用：
(1) 降低冰点，促进过冷却和“玻璃态化”的形成； (2) 提高溶液的粘滞性，阻止冰晶的生长， (3) DMSO可使膜物质分子重新分布，增加细胞膜 的透性，在温度降低时，加速细胞内的水流到细 胞外结冰，防止细胞内结冰的伤害； (4) 稳定细胞内的大分子结构，特别是膜结构，阻 止低温伤害，非透性保护剂的主要作用在质膜上。
四、超低温保存的基本设备和程序 1. 主要仪器设备 (1) 用于组织和细胞培养的全套设备； (2) 普通电冰箱；
(3)-70 ℃- -80℃的低温冰箱；
(4) 程序降温器；
(5) 玻璃或塑料试管（5ml 或10 m1），封盖严密， 不进液氮；
(6) 液氮;
(7) 光学显微镜和紫外荧光显微镜；
(8) 分光光度计.
(8)当愈伤组织长到良好状态时，转移到分化培养基上， 检验形态发生能力的保持情况。
(9)植株形态特征、生长发育及遗传性状的观察和分 析．
八、 原生质体的超低温保存
已有10种以上植物(地钱、无芒雀麦、曼陀 岁、胡萝卜、大豆、烟草、颠茄、大麦、小 麦、玉米等)的原ห้องสมุดไป่ตู้质体成功进行了超低温保 存。
操作程序如下： (1)将来源于花药的胚性愈伤组织按常规酶法分离出 原生质体。 (2)将收集有原生质体的离心管插入冰浴中，待温度 平衡后，加入在0℃预冷的冰冻保护剂(5％DMSO+10％ 葡萄糖)。轻轻悬浮原生质体后，在0℃放臵15分钟。
5．化冻方法 实验证据证实，植物的冻害常发生在冰凉 和化冻两个过程。因此要使植物种质的超低 温保存获得成功，不仅要求有一个合适的降 温冰冻程序，而且还要求采取合适的化冻方 法，以避免在化冻过程中产生细胞内的次生 结冰，并应防止在化冻吸水过程中水的渗透 冲击对细胞膜体系的破坏。
通常采用快速化冻方法，即将液氮保存后 的材料在37—40℃的温水浴中化冻。因为超 低温冰冻材料化冻时，再次结冰的危险温度 区域大约是—50℃至—10℃。从理论上说， 借助迅速的化冻速度通过此温度区，从而避 免细胞内次生结冰。
五、影响超低温保存放果的一些主要因素 1．材料的特性；
基因型、抗冻性、器官组织和细胞年龄、生 理状态。
2．预处理 目的：A. 增加细胞分裂和同步化； B. 减少细胞内自由水的含量； C. 增强细胞的抗寒性。
预处理方法：
(1)细胞、组织继代培养中．细胞分裂分化同 步化的调控，增加指数生长期细胞。 (2)预培养，增加培养基中的糖浓度，提高渗 透压；或在预培养基中加入诱导抗寒力的物质 或冰冻保护剂，如脱落酸(ABA)，山梨糖醇、 脯氨酸及二甲基亚砜(DMSO)等。 (3)低温锻炼：如香石竹茎尖经4℃低温预处理 14天，不仅提高了存活率．而且分化率从30％ 增加到60％。