丛枝菌根实验方案

丛枝菌根实验方案

1.李晓林(1990)采用三室的试验装置，利用30μm的尼龙网将根与菌丝分开，建立了菌丝

际。该方法为研究菌丝及其菌丝际的生理生化变化提供了一条有用的途径。但是它仍然不能排除外界微生物及灌溉施肥等措施造成的影响，为了进一步研究菌丝的生理生化变化，必须建立一种无杂菌的菌丝际环境，将离体双重培养条件下形成共生体中的根与菌丝分离开来，使菌丝进入菌丝室，而将根阻止在菌根室中，不让二者混在一起，为深入研究菌根菌丝的生理生化特性提供新的技术和方法。

2.Glomus intraradices孢子较小，其直径为44μm一117μm，平均77μm，呈椭球形或

球形，颜色为淡黄色，其孢子的萌发是从联孢菌丝的断口处重新伸出菌丝(图4—1图版I一6)，而后再伸长、分枝，形成一个密集分枝的菌丝体。它的萌发不同于G．margarita 孢子和S．sinuosa孢子果的萌发。虽然较前两种孢子和孢子果的芽管数略少，但它仍具有很强的侵染潜力，可能同其具有很强的分枝能力有关。一旦萌发，菌丝的分枝速度很快。G．intraradices菌丝的分枝呈垂直方向。新生成的菌丝较联孢菌丝直径更细，对根段进行侵染会更容易。

3.菌根室中共生联合体的建立：将有机玻璃条用玻璃胶黏贴在直径为9cm的培养皿底部，

将培养皿分为两室，防止两室的培养基质进行营养交换。将30μm的尼龙网黏贴在有机玻璃条及培养皿壁，直至培养皿上盖，阻止根的进入(图4—2)。将转移RiT—DNA 胡萝卜根与萌发的G．intraradicesSchenck&Smith丛枝菌根真菌孢子，共同培养的室称为菌根室(MC)，而将菌丝穿过尼龙网进入的室称为菌丝室(HC)。图4—2培养皿中的两室试验装置将M培养基10mL倒入菌根室中，用于离体双重培养丛枝菌根真菌与转移RiT—DNA胡萝I-根。在菌丝室中：①倒入10mL的琼脂培养基质，其中含有NO3-N 或NH4-N(N的含量与M培养基中相同)，其pH分别为6．0或6．5，基质中含有0．6％溴甲酚紫作为指示剂；②倒入10mL不含蔗糖的M培养基，pH为5．5。在相应的菌根室中接种G．intraradices孢子。截取在M培养基上生长的转移RiT—DNA胡萝i-根的根尖5cm-7cm置于菌根室中，将萌发的孢子移入根旁空处，由于G．intraradices孢子直径小，每个培养皿移进30个孢子。将培养皿在27℃±1℃的恒温培养箱中黑暗培养。

4.菌根室中共生联合体生长状况：G．intraradices菌根真菌相似于G．margarita菌根真菌，

其生成的菌丝在与根相遇时入侵根段，在根细胞内形成丛枝。培养近一个月后，在培养基质中形成了大量的营养孢子及成熟的孢子(图4—3)。营养孢子的大小为4lμm-62μm，平均为49μm，而成熟孢子的大小范围是67μm一93μm，平均大小为78μm。

成熟的孢子颜色较暗，孢子壁较厚。营养孢子中充满油滴，可以为菌丝的生长提供能源物质。

5.在观察菌丝生长的过程中，菌根真菌的菌丝中能观察到原生质的双向流动。菌丝内原生

质的双向流动有助于进一步探索菌丝对物质运输的作用。菌丝内原生质的双向流动是菌根真菌的一种普遍现象，菌根真菌与宿主共生联合关系的建立也依赖于这种双向流动的驱动力(Smith，1997)。孢子不仅是作为丛枝菌根真菌养分储存的器官，更是一种稳定的繁殖体，它的形态特征目前仍是丛枝菌根真菌分类学的重要依据。目前孢子收集的方法主要有湿筛倾析法、柱析法、漂浮法和离心法，但是常用的方法仍是湿筛倾析法和离心法(李晓林、冯固，2001)。这些方法的共同点都是能够将菌根孢子从生长基质中富积起来，但是孢子与基质的小颗粒特别是沙粒颜色相近，不易于辨别。

6.测定丛枝菌根孢子密度方法一：常规的湿筛倾析法(Gerdemann和Nieolson，1963)：(1)

称取一定重量的土壤样品，放在容器内用水浸泡20min-30min，尽量使土壤松散。如果土壤黏性很大，也可加入各种土壤分散剂。(2)选用一套洁净的、孔径为0．5μm一0．034μm的土壤筛，按孔径由大至小的顺序从上到下依次叠放，最底层用一固体物垫着，使筛面稍微倾斜。(3)用玻璃棒搅动浸泡土壤的水溶液，停置几秒钟后，使大的石砾和杂物沉淀下去，然后将悬浮的土壤溶液慢慢地倒在最上一层的土壤筛上，倾倒时，集中倒在筛面的一个点上，避免整个筛面都沾有土壤溶液。(4)用清水依次轻轻冲洗停留在筛面上的筛出物，以免在上层粗筛面的剩留物中残留有丛枝菌根真菌孢子，用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的培养皿里面。(5)将滤液通过细筛并用水冲洗。

在细筛面上冲洗下来的筛出物中，除了有许多细的沙砾和杂质外，就含有丛枝菌根真菌的不同直径的孢子。(6)将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察并计数。

7.测定丛枝菌根孢子密度方法二：湿筛倾析染色法(简称染色法)改进的湿筛倾析法，前4

步骤同方法一。(5)用洗瓶将停留在筛面上的筛出物轻轻冲洗到一个清洁的试管内，滴加曲利苯蓝染色剂，放在90。C水浴锅或烘箱中加热半小时，进行染色。(6)将染色后的滤液通过细筛，并冲洗筛上的滤物，可洗去染色剂，将筛出物放在清洁的培养皿里。

在冲洗下来的筛出物中，除了有许多细的沙砾和杂质外，就含有丛枝菌根真菌的不同直径的孢子。(7)将含有筛出物的培养皿放在双目实体解剖显微镜下观察并计数，可观测到紫色孢子。

8.两种方法对菌根孢子的形态特性以及测定精度比较：由于孢子是菌根生态分类的主要依

据。孢子在土壤中主要呈无色透明、白色、淡黄、黄棕、棕色、金黄、红棕和黑色等颜

色(李晓林、冯固，2001)，许多孢子的颜色与基质沙土的颜色相近，在计数时不易被分辨出来而造成计数误差。利用两种不同的方法来观测菌根孢子的形态特性，发现有明显的区别。常规的湿筛倾析法，在双目实体解剖显微镜下观测到孢子呈棕黄色(图5—1图版11—1)，且孢子颜色与沙粒接近。而利用染色法观测到孢子呈紫色(图5～2图版Ⅱ一

2)，通过湿筛倾析法筛选出的菌根孢子或多或少带有菌丝，菌丝同时也被染色，与周围

沙粒颜色反差较大，观测孢子形态特性比较明显，孢子的图5—1湿筛倾析法观测到孢子形态(棕黄色)图5—2染色法观测到的孢子形态(紫色)识别更是一目了然。因此菌根孢子很容易在染色剂作用下着色，呈紫色。在显微镜下观测孢子的数量，效果明显，易于识别，同时降低了孢子密度测定过程中的人为误差，提高了孢子密度测定的精度，染色后的孢子(紫色)比没染色的孢子(棕黄色)易于观测，可以明显地提高计数工作效率。以宁夏大武口煤矸石山接种菌根处理的沙土样品为例，本试验条件下以传统的湿筛倾析法来统计孢子密度，10g沙土样品孢子数平均为350个。而利用染色法来测定相同样品的孢子数平均为380个。每个土壤样品精度上平均提高了8％，染色法较常规的湿筛倾析法更易于识别和辨认，提高了孢子密度测定的精度。丛枝菌根培养新技术及其对土地复垦生态效应识别更是一目了然。因此菌根孢子很容易在染色剂作用下着色，呈紫色。在显微镜下观测孢子的数量，效果明显，易于识别，同时降低了孢子密度测定过程中的人为误差，提高了孢子密度测定的精度，染色后的孢子(紫色)比没染色的孢子(棕黄色)易于观测，可以明显地提高计数工作效率。以宁夏大武口煤矸石山接种菌根处理的沙土样品为例，本试验条件下以传统的湿筛倾析法来统计孢子密度，10g沙土样品孢子数平均为350个。而利用染色法来测定相同样品的孢子数平均为380个。每个土壤样品精度上平均提高了8％，染色法较常规的湿筛倾析法更易于识别和辨认，提高了孢子密度测定的精度。

9.两种方法对孢子密度测定速度的比较：常规的湿筛倾析法测定孢子密度，本研究条件下

需要45min-50min时间来计数完成一个样品(350个孢子／10g)。而利用染色法则需要花费25min～30min时间来计数完成1个样品(380个孢子／10g)，测定速度上1个样品缩短了一半时问(25 min-30min)，本试验40个土样，在测定速度上节约1000min一1200min，即20h。40个样品在染色过程中可以一次在水浴锅或烘箱中进行染色30min，操作简单可行且染色时多个样品可以一次完成，耗时少，染色法与常规的湿筛倾析法相比，仅多了染色一个环节，因此利用该染色法能够极大地提高孢子密度测定的速度，为大规模样品的孢子密度监测提供了一种快速的方法，尤其对于初学菌根技术的人更是一