丛枝菌根研究方法

丛枝菌根研究方法

1.检测孢子含量的方法（湿筛倾注蔗糖离心法）

1.Gerdemann J W, Nicolson T H,1963. Spores of mycorrhizal endogone species extracted from soil by wet sieving and decanting. Transactions of the British Mycological Society, 46: 235-244

2.刘润进，李晓林．2000．丛枝菌根及其应用．北京：科学出版社：190-194

根据上述方法略有改动

1.称取10 g菌剂，置入大烧杯中加500 ml水，搅拌，静置10 s。

2.先后过80目分样筛、400目分样筛，将400目筛子上的残余物用药匙转入50ml 离

心管中，后用清水冲洗筛子，将残余物全部转入离心管中，配平，3000转/min 离

心10 min。（注分样筛最好直径为12 cm左右，便于下面放置烧杯过筛）

3.去掉上清液，在离心管中加入预先配制好的质量分数为50%的蔗糖溶液，玻璃棒搅

匀，配平，3000转/min 离心10 min（注意离心前离心管壁上不能有残余物）。

4.将400目筛子呈一斜面放置，离心后的蔗糖溶液过筛子的下侧，用水将筛子上的残

留物轻轻洗入划线培养皿中。（注意水不能加太多以防影响检测，培养皿划线便于

统计）。

5. 解剖镜镜检统计培养皿中的孢子数目，计算出菌剂中的孢子含量。

注：溶于蔗糖溶液中的孢子仍可进行接种。

2.检测菌根侵染率的方法（曲利苯蓝染色法）

Phillips J M，Hayman D S，1970. Improved procedures for clearing and staining parasitic and vesicular-arbuscular mycorrhizal fungi for rapid assessment of infection. Transactions of the British Mycological Society, 55: 158~161

根据上述方法略有改动

1.将洗净的幼苗根系剪成1 cm左右的根段，用FAA固定液（70%酒精：甲醛：冰醋

酸=90：5：5）固定24 h。

2.加入10% KOH在100℃的恒温干燥箱内反应45 min(去除细胞质，便于染色。一般

来说，幼根需要时间较短，大约只要0.5 h，老根需要时间长，大约1 h，以根系相对透明为标准)。

3.洗去碱液，加入10% H2O2漂白15 min，用蒸馏水清洗，加入0.2 mol·L-1盐酸酸化

1h以上(可以延长，曲利苯蓝为酸性染料，需酸化，酸化时间应不少于30 min)。

4.曲利苯蓝(Trypan blue)乳酸酚溶液(乳酸100 mL，甘油100mL，苯酚100 mL,蒸

馏水100 mL，曲利苯蓝0.2 g)染色5 min。

5.乳酸酚(乳酸100 ml，甘油100 mL，苯酚100 mL,蒸馏水100 mL)脱色15min。

6.制片，镜检。

7.试验中可用自来水代替蒸馏水,苯酚有毒，进行染色、脱色步骤时需在通风橱中进行，

实验人员需戴口罩。

说明：常规制片用水即可，用封固剂（聚乙烯醇1.66g，甘油1 ml，乳酸20ml ，蒸馏水10ml）制片片子可以保存较长时间，但容易产生气泡，另聚乙烯醇有毒需小心。

经脱色后的植物根系可以在甘油中保存数月。

3.统计方法

•Trouvelot A, Kough JL & Gianinazzi-Pearson V (1986)

Mesure du taux de mycorhization VA d’un système

radiculaire. Recherche de méthodes d’estimation ayant

une signification fonctionnelle. In : Physiological and

Genetical Aspects of Mycorrhizae, V. Gianinazzi-Pearson and S. Gianinazzi (eds.). INRA Press, Paris, pp. 217-221.

Estimation of AMF colonisation

Estimation of mycorrhizal colonization according to Trouvelot et al

丛枝菌根真菌侵染性的评估方法(Trourelot等，1986)

a. Mount 15 root fragments on one slide; prepare two slides (30 root fragments total).

1.将15个根段固定在1张载玻片上，30个染色后的植物须根根段制2个片子。

b. Observe these fragments under the microscope and rate according to the range of classes indicated in figure 1. These classes give a rapid estimation of the level of mycorrhizal colonisation of each root fragment and the abundance of arbuscules.

2.在显微镜下观察这些根段，按照图1的分类方法确定分级，这种分级包括对每个根段菌根侵染率水平和丛枝丰度的快速评估。