疯牛病的检测及研究现状

疯牛病的检测及研究现状
摘要：近年来,对TSE检测的研究发展非常迅速。

尽管朊病毒的分类本质尚不明确,但一些生物学特性已有研究,如传染性、抵抗力等,其检测技术包括:早期利用宿主动物牛或转基因小鼠的生物学方法;有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,
关键词：疯牛病；TSE；检测
疯牛病（Transmissible spongiform encephalopathy，TSE)可传播海绵状脑炎,由朊病毒引起的一类进行性、不可治愈的致死性疾病的统称,主要特征为痴呆,验尸时脑部有空洞;当一种哺乳动物食用另一种哺乳动物的脑或脊髓时可传播。

自1986年英国首次报道疯牛病以来，12年间疯牛达17万头以上，英国政府赔偿费用超过1.35亿英镑；有疯牛病的牛群要全部杀灭，牛及牛肉不能出口，经济捐失巨大。

疯牛病风云从欧洲扩展到世界各地。

美国发现疯牛病，6个月损失30亿美元。

食用被疯牛病污染了的牛肉、牛脊髓的人，有可能染上致命的克罗伊茨费尔德—雅各布氏症（简称克－雅氏症），其典型临床症状为出现痴呆或神经错乱，视觉模糊，平衡障碍，肌肉收缩等。

病人最终因精神错乱而死亡。

英国政府海绵状脑病顾问委员会的一位科学家警告说：因疯牛病死亡的人数将以每年30%左右的速度逐年上升，最终每年可造成成千上万人丧生。

迄今为止死于此疫的人数为69人，另有7例死亡事件可能与疯牛病有关[1]。

迫切需要发展准确可靠的诊断技术，全面监测、检测朊病毒病，特别是做到对疯牛病和医源性感染的早期预防。

1.TSE病原体
传染疯牛症的物质，不是病毒和细菌，它是藏在患有疯牛症的牛只身体内的一种化学物质，这些物质称为普因（prion），又名朊病毒，就是蛋白质病毒，是只有蛋白质而没有核酸的病毒。

是可以引起同种或异种蛋白质构象改变而致病或功能改变的蛋白质。

朊病毒是只有蛋白质而没有核酸的病毒。

最常见的是引起传染性海绵样脑病(疯牛病)的蛋白质。

每种牛只身体都有普因，但在患有疯牛症的牛只的身体内，该普因改变了形状，使它可以对抗破坏它的蛋白酵素。

1997年诺贝尔医学或生理学奖的获得者美国生物学家斯垣利·普鲁辛纳（S. B. Prusiner）就是由于研究朊病毒作出卓越贡献而获此殊荣的。

朊病毒与常规病毒一样，有可滤过性、传染性、致病性、对宿主范围的特异性，朊病毒大小只有30一50纳米，电镜下见不到病毒粒子的结构；经负染后才见到聚集而成的棒状体，其大小约为10～250 x 100～200纳米。

通过研究还发现，朊病毒对多种因素的灭活作用表现出惊人的抗性。

TSE因子对外界灭活的抵抗力很强，对各种消毒（煮沸、冷冻、高压灭菌、乙醇、双氧水、过锰酸盐、碘、甲醛、紫外线外线、γ射线等）均有耐受性。

对物理因素，如紫外线照射、电离辐射、超声波以及80～100℃高温，均有相当的耐受能力。

对化学试剂与生化试剂，如甲醛、羟胺、核酸酶类等表现出强抗性。

能抵抗蛋白酶K的消化。

在生物学特性上，朊病毒能造成慢病毒性感染而不表现出免疫原性，巨噬细胞能降低甚至灭活朊病毒的感染性，但使用免疫学技术又不能检测出有特异性抗体存在，不诱发干扰素的产生，
也不受干扰素作用。

总体上说，凡能使蛋白质消化、变性、修饰而失活的方法，均可能使朊病毒失活；凡能作用于核酸并使之失活的方法，均不能导致朊病毒失活。

由此可见，朊病毒本质上是具有感染性的蛋白质。

普鲁辛纳将此种蛋白质单体称为朊病毒蛋白（PrP）[2]。

2.检测方法
在过去几年中,介入TSE诊断领域的公司急剧增加,主要原因在于潜在的巨大市场利润,一方面是对牛群是否感染的检测,欧盟要求对所有30月龄以上的牛进行检测;另一方面是对生物制品,主要是血液制品的检测,也包括疫苗生产原材料如小牛血清的检测。

2.1免疫学诊断
TSE诊断的实际应用需要更加快速并且可同时检测大量样本的方法,目前有多种免疫诊断方法可区分正常和异常的朊病毒蛋白,可以满足这一需求。

欧盟验证了三种免疫诊断方法,瑞士Prionics公司的免疫印迹法、爱尔兰Enfer Scientific 公司的ELISA法和法国CEA和英国Bio-Rad公司开发的夹心免疫法验证研究包括检测300 份感染TSE牛脑组织样本,1000份来自正常牛样本,结果表明,三种检测方法准确性为100% ,无假阳性和假阴性,因此,欧盟授权这三种检测方法用于欧洲检测疯牛病[3]。

Pronics公司的Pronics Check法采用Western blot法检测朊病毒蛋白,全程需要24 小时,自1999 年初已为瑞士和英国授权用于牛的过筛检测,并可对处于潜伏期动物进行BSE检测。

其推荐使用的Invit2rogen公司生产的蛋白电泳凝胶NuPAGE最近已获美国专利。

Prionics公司最近与Roche公司签定了协议,一方面推广其产品,另一方面合作开发对活动物进行血液检测的试剂,鉴于血液中所含朊病毒少,这一研究预计需要较长时间。

CEA/ Bio2Rad公司的Platelia试剂采用夹心免疫法,约4小时出结果,尤其适用于有大量样本的情况下,该产品预计将有每月1 百万的生产量,目前在德国等欧洲国家的销售良好，该方法最近与传统接种动物的方法平行对比,检测感染TSE牛脑组织稀释样本,结果表明至少其准确性良好,有可能用于检测处于潜伏期的标本。

目前该公司同样着力于对血液标本检测的研究和开发。

Enfer的产品为ELISA法,24小时可出结果,通过采用自动化仪器可用于高通量检测。

目前主要在爱尔兰使用,用于检测宰杀后人用牛脊髓和感染BSE牛的检测。

其他一些公司也在着力开发免疫诊断试剂。

如EGGWallac的基于免疫荧光方法的Delfia试剂,敏感性非常高,也经过了欧盟的评价,因结果不理想而未获欧盟授权使用,但英国农渔食品部(MAFF)同意将其用于检测英国的牲畜以进行确证,并推荐由欧盟进行再次评估。

目前欧盟正考察其他5 种检测方法,并欢迎其他研究者的检测方法。

2.1其他方法
研究人员还尝试通过对TSE感染过程中出现的相关蛋白、朊病毒的形态变化的检测来诊断TSE。

德国的研究人员发现[4],朊病毒对神经细胞产生毒性的原因在于引起神经细胞的凋亡,这一过程中出现的特异性相关蛋白可作为检测的目标,脑脊液中的14-3-3蛋白被证明是朊病毒引起神经细胞凋亡的标记,目前已开发一种敏感方法检测这一蛋白,有可能用于诊断。

此外针对TSE发病过程中,异常的朊病毒蛋白在脑部出现聚集,也有研究者采用不同手段用以诊断疯牛病。

毛细管电泳检测毛细管电泳包括:①毛细管SDS凝胶电泳,该法主要是根据各组分通过检测器时,在214 nm波长处产生吸收峰的时间和峰形,鉴别出病原因子—PrPsc。

该法标本用量少,不需免疫学试剂,判断直观;但需超速离心机和毛细管电泳仪。

②荧光标记肽链的毛细管电泳免疫测定法,是根据免疫竞争原理,以毛细管电泳技术结合免疫荧光技术,检测标本中微量的PrPsc。

该法灵敏度很高,可用于检测朊病毒含量很低的脑外组织(如血液等)[5]。

双色强荧光目标扫描法该法是运用共聚焦双色荧光相关分光镜技术检测微量的朊病毒。

根据异常的朊病毒蛋白在适当条件下自我复制和自发聚集的特点,分别用绿色荧光标记重组的PrP(rPrP)和标有红色荧光的特异性抗体进行反应,其结果中同时显示红、绿两种荧光的颗粒,即可被仪器检测为具有侵染性的朊病毒蛋白PrPsc。

该方法特异性很好、灵敏度极高,可检测到2pmol/L的PrPsc[6]。

检测采样早期大都是基于机体脑部组织,随着检测研究的深入及灵敏度的提高,逐渐发展了其他组织检测。

英国、德国、瑞士等国成功地以血液为检测对象检测TSE,美国、以色列等国以尿液为检测对象检测TSE。

其次,在淋巴液及扁桃体等可检测到PrPsc,还可根据脑脊液中脑蛋白14-3-3在感染PrPsc前后含量的变化来检测TSE,称为脑脊液中标志蛋白的检测。

Giese等应用共聚焦双染色荧光相关光谱的方法,开发了一种对脑脊液标本进行检测的高敏感诊断方法,这一技术甚至可以检测到单一分子。

首先用染料标记的特异抗体与朊病毒蛋白聚集体结合,得到高荧光强度的靶位,然后进行测量和分析,比免疫印迹法还要敏感,可为TSE 诊断提供快速、特异的检测方法[7]。

目前已有多种商品化的检测TSE的试剂盒,它们大多应用于脑或淋巴组织,应用于血液检测仍有一些障碍,包括检测方法的确证、在大量PrPc中检测极少量的PrPsc、缺乏现成的标准物质、方法的特异性和大规模使用的实用性等。

3.结束语
总之,对TSE的病原特征,致病机制及传染途径要有一个科学清醒的认识。

通过严格的防制措施,加强海关检验检疫,加强宣传,严把食品药品关,谨防病从口入,TSE是一定可以得到预防和控制的。

基于投入力度的增加,TSE检测的研究发展非常迅速,相信在未来几年,多种敏感且特异的诊断方法将广泛应用。

参考文献：
[1] Collinge J. Prion diseases of humans and animals: their causes andmolecular basis[J]. Annu Rev Neuro Sci, 2001, 24: 519-550.
[2] Erimias D. Transmissible spongiform encephalopathies in humans[J]. Ann Rev Microbiol, 1999, 53:283-314.
[3] 马文丽,郑文岭.疯牛病的分子基础与临床[M].北京,科学出版社,2003:24-43.
[4] Prusiner SB. Prion disease and the BSE crisis[J]. Science, 1997,278: 245-251.
[5]许于飞,贾小明.朊病毒分子生物学研究进展[J].中国人兽共患病杂志,2002,18(4):105-107.
[6] Aranha Haze and Martin. Potential prion risks and clearance by filtra2tion[J]. Genetic engeneering news 2001 , 21(11) :58.
[7]Aldridge Susan. Novel BSE test systems[J]. Genetic engeneering news2001 ,21 (6) :1.。