荧光原位杂交实验 Fluorescence In Situ Hybridization精选版

Biotin(BIO)-11-dUTP Digoxygenin(DIG)-11dUTP Dinitrophenyl (DNP)11-dUTP
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染色体复染的物质: Propidium Iodide (PI)（红色） DAPI（兰色） quinacrine（绿色）
chromomycine A3（绿色）
**FISH技术的应用 1）基因（或DNA片段）的染色体定位； 2）染色体数目与结构异常的检测； 3）间期细胞遗传学（绒毛/羊水/精子/卵裂球/其它间期细胞研究与 诊断）； 4）肿瘤遗传学研究
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**用于FISH的探针 1）单拷贝探针： （1）种类：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段
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DNA for probe use is labeled with fluorescent (direct method) or non fluorescent molecules which are then detected by fluorescent antibodies (indirect method). The probes bind to a specific region or regions on the target chromosome. The chromosomes are then stained using a contrasting color, and the cells are viewed using a fluorescence microscope.
应用
（1）染色体数目和结构异常分析； （2）不同物种间的同源性比较； （3）白血病及其它肿瘤的染色体诊断和研究。
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kΒιβλιοθήκη Baiduk
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多色FISH（muti-color FISH) 多色复合染色体FISH探针(multiplex FISH, M-FISH probes) #两种以上不同的非同位素标记，不同的荧光检测系统， 通过不同的滤光片组合或极少数几种非同位素标记探针 后，按照不同的比例混合，可以显示多种颜色。
（2）应用 （a）定位DNA片段及嵌合体克隆验证； （b）确定染色体微小缺失与重复； （c）染色体断裂点分析。 （d）间期细胞染色体数目异常诊断。
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DNA片段的染色体定位
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FISH检测微小缺失
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染色体片段重复 Dup 19(p13.2-13.1
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21q22.2 BAC克隆在Down综合征间期细胞中的杂交信号
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FLUORESCENT labeled dUTP
HAPTENE labeled dUTP
AMCA-6-dUTP CascadeBlue-4-dUTP Fluorescein-12-dUTP Rhodamine-6-dUTP TexasRed-6-dUTP Cy3-6-dUTP Cy5-dUTP
探针来源： （1）含有人单条染色体的人-啮齿类(human-rodent)体细胞杂 种组织融合的产物； （2）荧光激活的流式细胞仪(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分离整条染色体DNA，并以载体克隆/PCR 扩增； （3）显微切割得到染色体或染色体片段，PCR扩增；
荧光原位杂交实验
Fluorescence In Situ Hybridization
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原位杂交(In situ hybridization)
1）同位素原位杂交(Isotopic in situ hybridization) ——70年代 2）非同位素原位杂交(Non-isotopic in situ hybridization) ——80年代中后期
（1）免疫酶联 （2）荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization, FISH)
**同位素原位杂交的不足之处：
1）不稳定； 2）高背景； 3）曝光时间长； 4）结果统计学处理繁琐。 5）同位素的使用和处理
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实验的基本原理:
FISH is the detection of highly specific DNA probes which have been hybridized to either interphase or metaphase chromosomes using fluorescence microscopy.
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**间期细胞遗传学的意义：
细胞分裂期仅占整个细胞周期的几分之一至几十 分之一，经细胞培养和相应处理才能获得染色体。 人体的大部分细胞并不进行分裂，很难通过培养 获得中期染色体分裂相，间期FISH为这一时期 遗期传物质的研究提供了可能，而且快速。
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３）染色体涂染探针(chromosome painting probes) 整条染色体探针或染色体区带特异性探针
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**荧光原位杂交的特点：
1）快速；2）信号强；3）特异性高；4）多色。
**FISH有上述优点的原因：
使用了荧光标记与检测系统取代放射性标记与检测系统
标记探针的物质：（1）生物素(biotin)/地高辛(digoxigenin) ——半抗原报告分子（间接标记） （2）荧光物质（直接标记）
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染色体“原位抑制”杂交（chromosome in situ suppression, CISS) 克服散在的重复序列造成的杂交背景，提高信号的特异性，在探针 中加入过量的未标记的竞争性DNA(competitor DNA)，如human Cot-1 DNA，进行杂交前的预复性。探针中的重复序列与加入的竞 争物中的大量重复序列优先复性，而特异性的单拷贝序列因竞争物 中同源序列拷贝数少，绝大部分仍保持单链状态。
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２）简单重复序列探针(simple repetitive probes) ——异染色质着丝粒探针(heterochromatic centromer probes)
其靶序列为α卫星DNA或卫星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色体的着丝粒和异 染色质区域，重复数百次至数千次。 特点：信号强 应用：(a)标记染色体识别 (b)染色体数目异常检测 (c)间期细胞遗传学研究和临床诊断