海洋真菌 - 讲义海洋真菌
211050068_海洋真菌Pestalotiopsis_sp.甾体化合物的分离纯化及抗肿瘤活性研究
引用格式：雷辉, 夏童, 王佳女, 等. 海洋真菌Pestalotiopsis sp.甾体化合物的分离纯化及抗肿瘤活性研究[J]. 中国测试，2023,49(3): 60-64. LEI Hui, XIA Tong, WANG Jianü, et al. Separation and purification of sterols from marine fungus Pestalotiopsis sp. and study on its anti-tumor activity[J]. China Measurement & Test, 2023, 49(3): 60-64. DOI: 10.11857/j.issn.1674-5124.2021120105海洋真菌Pestalotiopsis sp.甾体化合物的分离纯化及抗肿瘤活性研究雷 辉1， 夏 童2， 王佳女2， 熊 霞2， 刘 利2(1. 西南医科大学药学院，四川 泸州 646000; 2. 西南医科大学附属医院，四川 泸州 646000)摘 要: 为了从海洋真菌次生代谢产物中获得抗肿瘤药物，该文对海洋真菌Pestalotiopsis sp.中的甾体化合物进行分离纯化、结构鉴定和抗肿瘤活性研究。
利用硅胶柱色谱，Sephadex LH-20 柱色谱等技术，从固体大米培养基发酵产物中分离纯化得到甾体化合物，鉴定为：4,4-dimethyl-5α-ergosta-8,24(28)-dien-3β-ol ，该化合物为首次从该属种分离获得，命名为：LH-1。
采用MTT 方法对该化合物进行体外细胞毒性测试，发现其可以选择性抑制肿瘤细胞的生长（IC 50：8.3 µmol/L ），而对正常细胞没有明显的杀伤作用。
该研究可为微生物来源的抗肿瘤先导化合物的发现提供实验基础。
关键词: 拟盘多毛孢属; 甾体; 结构鉴定; 抗肿瘤活性中图分类号: R932文献标志码: A文章编号: 1674–5124(2023)03–0060–05Separation and purification of sterols from marine fungus Pestalotiopsis sp.and study on its anti-tumor activityLEI Hui 1, XIA Tong 2, WANG Jianü2, XIONG Xia 2, LIU Li 2(1. School of Pharmacy, Southwest Medical University, Luzhou 646000, China;2. the Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou 646000, China)Abstract : To obtain antitumor drugs from secondary metabolites of marine fungi, the sterol constituents of marine fungus Pestalotiopsis sp. and its antimelanoma activity were studied. One compound was isolated from the extracts of solid rice medium by means of chromatographic techniques, including silica gel column and Sephadex LH-20 column chromatography. The structure was identified as 4, 4-dimethyl-5α-ergosta-8, 24 (28)-dien-3β-ol, which was isolated from the marine fungus Pestalotiopsis sp. for the first time and was named LH-1. The anti-tumor activities of LH-1 was screened by using the MTT. The result showed that compound LH-1exhibited selective inhibitor activities against anti-tumor cells and not toxicity to normal cells, with IC 50 value of 8.3 µmol/L. This study provides an experimental basis for the discovery of antitumor lead compounds from microorganisms.Keywords : Pestalotiopsis sp.; sterols; structure elucidation; anti-tumor activity收稿日期: 2021-12-27；收到修改稿日期: 2022-02-20基金项目: 四川省科技厅项目（2020YJ0191）；国家自然科学基金青年项目（82003716）作者简介: 雷 辉（1979-），男，河南信阳市人，讲师，硕士生导师，博士，研究方向天然产物分离、纯化及活性筛选。
海洋微生物
海洋微生物以海洋水体为正常栖居环境的一切微生物。
但由于学科传统及研究方法的不同,本文不介绍单细胞藻类,而只讨论细菌、真菌及噬菌体等狭义微生物学的对象。
海洋细菌是海洋生态系统中的重要环节。
作为分解者它促进了物质循环；在海洋沉积成岩及海底成油成气过程中，都起了重要作用。
还有一小部分化能自养菌则是深海生物群落中的生产者。
海洋细菌可以污损水工构筑物，在特定条件下其代谢产物如氨及硫化氢也可毒化养殖环境，从而造成养殖业的经济损失。
但海洋微生物的颉颃作用可以消灭陆源致病菌，它的巨大分解潜能几乎可以净化各种类型的污染，它还可能提供新抗生素以及其他生物资源，因而随着研究技术的进展，海洋微生物日益受到重视。
编辑本段【特性】与陆地相比，海洋环境以高盐、高压、低温和稀营养为特征。
海洋微生物长期适应复杂的海洋环境而生存，因而有其独具的特性。
嗜盐性海洋微生物最普遍的特点。
真正的海洋微生物的生长必需海水。
海水中富含各种无机盐类和微量元素。
钠为海洋微生物生长与代谢所必需此外,钾、镁、钙、磷、硫或其他微量元素也是某些海洋微生物生长所必需的。
嗜冷性大约90％海洋环境的温度都在5℃以下,绝大多数海洋微生物的生长要求较低的温度，一般温度超过37℃就停止生长或死亡。
那些能在0℃生长或其最适生长温度低于20℃的微生物称为嗜冷微生物。
嗜冷菌主要分布于极地、深海或高纬度的海域中。
其细胞膜构造具有适应低温的特点。
那种严格依赖低温才能生存的嗜冷菌对热反应极为敏感，即使中温就足以阻碍其生长与代谢。
嗜压性海洋中静水压力因水深而异，水深每增加10米,静水压力递增1个标准大气压。
海洋最深处的静水压力可超过1000大气压。
深海水域是一个广阔的生态系统,约56％以上的海洋环境处在100～1100大气压的压力之中，嗜压性是深海微生物独有的特性。
来源于浅海的微生物一般只能忍耐较低的压力，而深海的嗜压细菌则具有在高压环境下生长的能力，能在高压环境中保持其酶系统的稳定性。
海洋真菌生物活性物质研究之管见
海洋药物教育部重点实验室 中国海洋大学医药学院 青岛 266003
摘 要：海洋真菌是活性海洋天然产物的重要来源，到目前为止，已从海洋真菌的发酵产物中分离鉴定了 1,117 个新化合物。 介绍了海洋真菌次生代谢产物的研究历史、现状、特点、研究方法、存在问题及其在新药研究中的应用前景。 关键词：海洋真菌，次生代谢，活性产物，含氮化合物，卤代物
菌物学报
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图 2 1970-2010 年海洋真菌中发现的新化合物数量（Rateb & Rainer 2011）
Fig. 2 New compounds from marine fungi published in 1970-2010 (Rateb & Rainer 2011).
3 海洋真菌次生代谢产物的特点
4 海洋真菌次生代谢产物的研究方法
海洋天然产物研究较多的是海洋丝状真菌（霉 菌）。一般地，欲从海洋丝状真菌中获得新的活性 天然产物，首先要从大量的海洋真菌株中筛选出具 有活性新天然产物的生产菌株，即“天才菌株 （talented strains）”；其次是通过发酵优化、跟踪分 离、结构测定和活性评价，从“天才菌株”的发酵 产物中获得新的活性天然产物。
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ห้องสมุดไป่ตู้
图 3 1999-2003 年专利海洋天然产物的分类（Frenz et al. 2004）
Fig. 3 Category of active marine natural products in patents published in 1999-2003 (Frenz et al. 2004).
A review on studies of secondary metabolites from marine fungi
海洋真菌多样性的研究进展
属
种
属
种
属
种
Genera Species Genera Species Genera Species
Kohlmeyer and Kohlmeyer (1979)
62
149
4
4
40
56
Kohlmeyer and Volkmmann2Kohlmeyer (1991)
115
255
5
6
41
60
Hyde and Pointing (2000)
种类繁多 、生境复杂的微生物不仅在陆地上存在 ,而且在极端环境下也存在 ,是生物多样 性的重要组成 。海洋微生物作为海洋生物的组成部分 ,对它的研究可增加对海洋生物多样性 的了解 。早在 1914 年 Issatchenko 就写出了第一部有关深海微生物的专著 ,此后 Zobell 等又发 表了有关深 、浅海的海洋微生物学的巨著 ,指出在海洋中所有深度和纬度都有微生物存在 ,其 数量可由每毫升仅几个至几亿个 。海洋微生物相对于陆地微生物而言 ,能够耐受海洋特有的 如高盐 、高压 、低养 、低光照等极端条件 ,因而生活环境的特异性导致了海洋微生物在物种 、基 因组成和生态功能上的多样性 。但由于缺乏适当的培养方法 ,对海洋微生物多样性的了解较 少。
2 海洋真菌的定义与种类
海洋真菌是能在海水中繁殖和完成生活史 ,又能在海水培养基上良好生长的真菌类群 ,又 称海水真菌 。一些来源于海洋并能在海洋生境中生长与繁殖者 ,称专性海洋真菌 ;另一些来源 与陆地或淡水 ,但能在海洋生境中生长与繁殖者 ,称兼性海洋真菌 。几乎所有真菌都可在小于 海水中氯化钠浓度的条件下生长 ,因此耐盐性不能作为区分海洋真菌与陆地真菌的标志[4] 。
海洋抗菌活性物质
四、海洋微藻级生产者,种类多,繁 殖快 ,在海洋生态系统的物质循环和能量流动中起着极其 重要的作用。海洋微藻是海洋生态系统中的最主要初级生 产者，也是海洋生物资源的重要组成部分。
目前，国外对微藻生物活性物质的研究集中在蓝藻(又称 蓝细菌)和甲藻，从中发现了许多具有潜在药用价值的活 性次级代谢产物，表现为抗肿瘤、抗病毒和免疫抑制活性。
刘晨临等从青岛侧花海葵和绿海葵体分离到23 株真菌，并对其 产生的抑菌活性物质进行了初步测试。从23 株真菌中筛选出3株有较 好抗植物病原真菌活性的菌株，其中青11-1的代谢产物对立枯丝核菌 Rhizoctonia solani有较强的抑制作用。 李淑彬等从南海海泥中分离出一株编号为M182的霉菌，初步鉴定 为青霉Penicilliwn sp.该菌所产生的广谱抗生素M-182A，对细菌、 酵母真菌及丝状真菌均有抑制作用。
Cueto M等从巴哈马褐藻中分离到一株Pestalotia sp（盘多毛孢属） 菌,当它处于周围有抗性细菌存在的培养条件下,它能产生一种抗性物质。 这种抑菌物质对MRSA菌（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）最小抑菌浓度 37ng/ml,对VREF菌（耐万古霉素粪肠道球菌）最小抑菌浓度78ng/ml。微 生物之间的相互拮抗作用,对于从真菌中发现新颖的抗生素也许是非常有 用的。 Keissleriella sp YS4108是从中国黄海沉积物中分离到的一株真菌 ,发酵液分离提纯得到几种抗真菌次级代谢产物,其中一种聚酮类物质,拥 有全新的碳骨架,且显示出了对C.albicans（人白色念珠菌） ,Tricophyton rubrum（红色毛癣菌）和Aspergillus niger（黑曲霉）三 种菌的最小抑菌浓度分别为40,20和80μg/ml。 Proksch研究组从海绵Niphates olemda组织中分离出真菌Curvularia lunata（新月弯孢菌）,液体培养液中分离出一系列化合物,其中lunatin 和cytoskyrin两个蒽醌类衍生物。Lunatin在琼脂平板试验中对金黄色葡 萄球菌、大肠杆菌和枯草杆菌都有抑菌活性,5μg/mL时对三种菌的抑菌圈 直径达到8～9mm。
海洋微生物多样性及其功能性研究
海洋微生物多样性及其功能性研究海洋微生物是指在海洋中生活的一种微小的生物群体，包括细菌、真菌、病毒和单细胞生物。
这些微生物是海洋生态系统的基础，它们既是食物链的起点，同时也完成着其他生物无法完成的功能。
对海洋微生物的多样性及其功能性研究，可以深刻理解海洋生态系统的基本规律，解决环境污染和全球气候变化等问题。
一、海洋微生物多样性海洋微生物多样性是海洋生态系统重要的组成部分。
它在实现海洋生物多样性的同时，还发挥着重要的生态功能。
近年来，利用现代分子技术，科学家们对海洋微生物多样性的研究取得了重大突破。
（一）细菌的多样性细菌是海洋微生物中数量最多的一类，它们具有很强的适应性和免疫性，在海洋环境中扮演着不可替代的角色。
根据研究结果，海洋表层水域中，每毫升水中的细菌数目可达到10^6~10^7，而在深层海水中也可达到10^3~10^4，表明海洋中细菌群落的数量极为丰富。
细菌可以利用各种有机物和无机物作为营养源，因此它们的多样性很高，涵盖了多样的菌株和多个菌属。
通过对海洋微生物的生物分类学研究，发现大部分海洋细菌属于七个主要的菌门，包括变形菌门（Proteobacteria）、厚壳菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Actinobacteria）、Spirochaetes门、Planctomycetes门、Bacteroidetes门和绿弯菌门（Verrucomicrobia）。
（二）真菌的多样性真菌是一类海洋微生物，既缺乏光合作用，又不属于动物类，是一类重要的营养分解群落。
真菌的多样性研究主要基于其基因组学特征，利用分子生物学技术可以对海洋真菌的多样性及其进化关系进行研究。
事实上，海洋真菌的多样性比大多数科学家预期的要高得多，甚至可能存在着许多未知的物种。
目前已知的海洋真菌主要分为三类：酵母菌、接合菌和拟青霉菌。
其分布范围遍及世界各大洋，其中一些物种在丰富的有机质资源环境下能够生长繁殖迅速，导致海洋生态系统中物质能量的重新分配和循环。
海洋微生物
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利用综述
利用综述
海洋是生命的发源地，其生物多样性远远超过陆生生物。海洋生物包括海洋动物、海洋植物和海洋微生物。 海洋约占地球表面积的7l%，是一个开放、多变、复杂的生态系统。正是海洋特殊的物理、化学因素的复杂性， 造就了生命活动的复杂性，物种资源、基因功能和生态功能上的生物多样性。海洋中生物资源极为丰富，生物活 性物质种类繁多，并且正在为人类提供着大量的食品，多种材料和原料，具有可再生的特点。已引起世界各国的 重视，具有巨大开发潜力。
嗜压性
海洋中静水压力因水深而异，水深每增加10米，静水压力递增1个标准大气压。海洋最深处的静水压力可超 过1000大气压。深海水域是一个广阔的生态系统,约56%以上的海洋环境处在100～1100大气压的压力之中，嗜压 性是深海微生物独有的特性。来源于浅海的微生物一般只能忍耐较低的压力，而深海的嗜压细菌则具有在高压环 境下生长的能力，能在高压环境中保持其酶系统的稳定性。研究嗜压微生物的生理特性必需借助高压培养器来维 持特定的压力。那种严格依赖高压而存活的深海嗜压细菌，由于研究手段的限制迄今尚难于获得纯培养菌株。根 据自动接种培养装置在深海实地实验获得的微生物生理活动资料判断，在深海底部微生物分解各种有机物质的过 程是相当缓慢的。
海水中的营养物质虽然稀薄，但海洋环境中各种固体表面或不同性质的界面上吸附积聚着较丰富的营养物。 绝大多数海洋细菌都具有运动能力。其中某些细菌还具有沿着某种化合物浓度梯度移动的能力，这一特点称为趋 化性。某些专门附着于海洋植物体表而生长的细菌称为植物附生细菌。海洋微生物附着在海洋中生物和非生物固 体的表面，形成薄膜，为其他生物的附着造成条件，从而形成特定的附着生物区系。
北部湾海洋真菌Aspergillus_fumigatus_DL-p0m-g2_的化学成分及药理活性研
doi: 10.11978/2023045 北部湾海洋真菌Aspergillus fumigatus DL-p0m-g2的化学成分及药理活性研究冯婷, 孙建, 王玉妃, 盘伟斌, 覃旭灿, 覃炳云, 周丽曼, 王聪, 王佩, 孔凡栋广西民族大学化学化工学院, 林产化学与工程国家民委重点实验室, 广西林产化学与工程重点实验室; 广西林产化学与工程协同创新中心, 广西高校少数民族医药古方挖掘与开发重点实验室, 广西南宁 530006摘要: 为获得具有生物活性的化合物, 对一株分离于北部湾钉螺菌株Aspergillus fumigatus DL-p0m-g2的化学成分及药理活性进行研究。
综合应用反相ODS (octadecylsilyl) 柱色谱、半制备液相等多种色谱学方法进行分离纯化, 根据化合物理化性质、质谱和核磁共振波谱学数据进行结构鉴定, 并对分离得到的化合物进行细胞毒活性、抑菌活性和胆固醇转运蛋白NPC1L1 (NPC1-like intracellular cholesterol transporter 1)蛋白结合等生物活性评价。
实验共分离得到21个生物碱类化合物和1个甾体, 分别鉴定为6-methoxyspirotryprostatin B (1)、spirotryprostatin A (2)、fumitremorgin C (3)、cyclotryprostatin A (4)、fumitremorgin B (5)、pseurotin A (6)、azaspirofuran A (7)、azaspirofuran B (8)、cephalimysin C (9)、cephalimysin B (10)、fumiquinazoline C (11)、fumiquinazoline B (12)、fumiquinazoline A (13)、fumiquinazoline D (14)、fumiquinazoline F (15)、tryprostatin B (16)、verruculogen (17)、chaetominine (18)、bisdethiobis(methylthio)glitoxin (19)、helvolic acid (20)、7-deacetylpyripyropene A (21)、terezine D (22)。