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第5章 其它色谱方法
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纸层析和柱层析法 薄层色谱
高效毛细管电泳 超临界流体色谱
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纸层析
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一、纸层析分离过程
纸层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的 是在分离过程中一般不使用动力源。
纸层析流动相的移 动是依靠毛细作用。
将试样点在色谱滤纸 或层析板的一端，并将 该端浸在作为流动相的 溶剂（常称之为展开剂 ）中，随着溶剂向上的 移动，经过试样点时， 带动试样向上运动。 Rf 值相差越大，分离效 果越好
测仪 、记录仪
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（二）装柱
1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将 凝胶上面过多的溶液倾出。
2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积 的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾 入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打 开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待 沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱， 关闭出水口。
3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡， 影响液体在柱内的流动。
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二、操作技术
1.层析纸和层析板
特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层 析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝 ，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～ 0.5mm）。干燥后即可使用。
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2.展开剂
由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离 氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸： 水=4：1：1。
微型柱层析实验
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实例:
凝胶过滤层析纯化细胞色素C
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一、目的要求
1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。
2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化
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二、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离。
<700
<1500
<5000
150020000
300070000
4000150000
Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A
15.0
5000300000
20.0
5000500000
Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛
Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶
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（三）凝胶柱的平衡
通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝 胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时 凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。
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（四）加样
1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直 至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1 mL小 心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下 口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当 样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样 操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连 通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液 口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。
样品上柱
分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30%
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
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三、试剂与器材 试剂：0.01mol/l Tris-HCl缓冲液，PH7.5，含
0.2mol/l NaCl 器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检
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3. 点样
用微量注射器或玻璃毛细管吸取 一定量试样点在原点上。试样点的直 径一般应小于5mm。可并排点多个试 样同时展开。
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4.显色、检测
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下 用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显 色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。
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凝胶及柱的选择
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•凝胶的处理及装柱
凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡 装柱时要注意操作压。
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装柱的两种方法： a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘 米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加 入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
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（Βιβλιοθήκη Baidu）洗脱
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025 mol/LTrisHCl，以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集 器收集流出液。
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六、注意事项
1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。
2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的 操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
三、特点及应用
• 平板色谱简单、方便、及操作费用低， • 可以在一块层析板上同时展开多个试样及 将多条滤纸同时展开。 • 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展 开，即按一般方法展开后，改变方向和展开 剂再次展开，进一步改善分离效果。 • 试样一般不需要经过预处理即可分离。
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• 缺点： 分离效率较低，不适用挥发性试
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优点：
a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用
凝胶的类型：
Sephadex: 交联葡聚糖
G-10
G-15
G-25
G-50
G-75
G-100
G-150
G-200
吸水量
1.0
1.5
2.5
5.0
7.5
10.0
（g/g干凝 胶）
工作范围 （肽与蛋 白）D
样分离。定性定量不便。 • 应用：平板色谱法在染料、农药、医药、 有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、 蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经 常被使用。也可以用于无机离子的分离。还 经常作为高效液相色谱的一种预试方法。
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柱层析
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柱层析：是吸附色谱的一种，它利用吸附剂对不同物 质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗 脱分离的一种分离方法。
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纸层析和柱层析法 薄层色谱
高效毛细管电泳 超临界流体色谱
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纸层析
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一、纸层析分离过程
纸层析也属于色谱分析法。但与其它色谱方法不同的 是在分离过程中一般不使用动力源。
纸层析流动相的移 动是依靠毛细作用。
将试样点在色谱滤纸 或层析板的一端，并将 该端浸在作为流动相的 溶剂（常称之为展开剂 ）中，随着溶剂向上的 移动，经过试样点时， 带动试样向上运动。 Rf 值相差越大，分离效 果越好
测仪 、记录仪
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（二）装柱
1.装柱前，必须用真空干燥器抽尽凝胶中空气，并将 凝胶上面过多的溶液倾出。
2.先关闭层析柱出水口，向柱管内加入约1/3柱容积 的洗脱液，然后边搅拌，边将薄浆状的凝胶液连续倾 入柱中，使其自然沉降，等凝胶沉降约2-3cm后，打 开柱的出口，调节合适的流速，使凝胶继续沉集，待 沉集的胶面上升到离柱的顶端约5cm处时停止装柱， 关闭出水口。
3）始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分蒸发， 凝胶变干。也要防止液体流干，使凝胶混入大量气泡， 影响液体在柱内的流动。
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二、操作技术
1.层析纸和层析板
特制的色层滤纸。按需要剪裁成长条形（或筒型）。层 析板是用专门的涂布器把浆状的吸附剂（硅胶或氧化铝 ，200～250目）均匀地涂在长条形玻璃板上（厚度0.15～ 0.5mm）。干燥后即可使用。
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2.展开剂
由一种或多种溶剂按一定比例组成。如用纸层析分离 氨基酸时，常用的展开剂组成和配比为：正丁醇：乙酸： 水=4：1：1。
微型柱层析实验
19:59:33
实例:
凝胶过滤层析纯化细胞色素C
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一、目的要求
1.学习和掌握凝胶过滤层析分离蛋白质的 原理与方法。
2.通过凝胶过滤柱层析对细胞色素C进行纯 化
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二、原理
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物 质的分子大小不同来进行分离。
<700
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<5000
150020000
300070000
4000150000
Sepharose：琼脂糖凝胶 Bio-Gel A
15.0
5000300000
20.0
5000500000
Bio-Gel P：聚丙烯酰胺凝胶分子筛
Sephacryl：用N，N-亚甲双丙烯酰胺交联的葡聚糖凝 胶
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（三）凝胶柱的平衡
通过2-3倍柱床容积的洗脱液使柱床稳定，然后在凝 胶表面上放一片滤纸或尼龙滤布，以防将来在加样时 凝胶被冲起，并始终保护凝胶上端有一段液体。
19:59:33
（四）加样
1.准备好部分收集器、核酸蛋白检测仪及记录仪
2.打开柱上端的螺丝帽塞子，吸出层析柱中多余液体直 至与胶面相切。沿管壁将细胞色素C样品溶液1 mL小 心加到凝胶床面上，应避免将床面凝胶冲起，打开下 口夹子，使样品溶液流入柱内，同时收集流出液，当 样品溶液流至与胶面相切时，夹紧下口夹子。按加样 操作，用1 mL洗脱液冲洗管壁2次。最后加入3－4 mL洗脱液于凝胶上，旋紧上口螺丝帽，柱进水口连 通恒压瓶，柱出水口与核酸蛋白质检测仪比色池进液 口相连，比色池出液口再与自动部分收集器相连。
样品上柱
分析用量：柱床体积的1—2% 制备用量：柱床体积的20—30%
洗脱收集
部分收集器、核酸蛋白检测仪
凝胶的保存方法
0.02%叠氮钠或0.002%洗必泰
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三、试剂与器材 试剂：0.01mol/l Tris-HCl缓冲液，PH7.5，含
0.2mol/l NaCl 器材：层析柱、部分收集器、核酸蛋白质检
19:59:33
3. 点样
用微量注射器或玻璃毛细管吸取 一定量试样点在原点上。试样点的直 径一般应小于5mm。可并排点多个试 样同时展开。
19:59:33
4.显色、检测
有些组份在紫外光照射下产生荧光，可在紫外灯下 用铅笔将组份斑点描绘出来。常用的显色方法有喷洒显 色剂、碘蒸气熏或氨水熏等。
19:59:33
凝胶及柱的选择
19:59:33
•凝胶的处理及装柱
凝胶干粉的溶胀（热溶 胀）、浮选、抽气、装 柱、蓝色葡聚糖检查、 平衡 装柱时要注意操作压。
19:59:33
装柱的两种方法： a.手工操作
1/3床体积水→加入少许凝胶积起1-2厘 米凝胶床→打开出水口→连续缓慢加 入凝胶
b.电动搅拌下的装柱法
19:59:33
（Βιβλιοθήκη Baidu）洗脱
洗脱时，打开上、下进出口夹子，用0.025 mol/LTrisHCl，以每管3 mL/10 min流速洗脱，用自动部分收集 器收集流出液。
19:59:33
19:59:33
六、注意事项
1）各接头不能漏气，连接用的小乳胶管不要有破损， 否则造成漏气、漏液。
2）装柱要均匀，既不过松，也不过紧，最好在要求的 操作压下装柱，流速不宜过快，避免因此压紧凝胶。
三、特点及应用
• 平板色谱简单、方便、及操作费用低， • 可以在一块层析板上同时展开多个试样及 将多条滤纸同时展开。 • 采用方形薄层板还可以方便的进行二维展 开，即按一般方法展开后，改变方向和展开 剂再次展开，进一步改善分离效果。 • 试样一般不需要经过预处理即可分离。
19:59:33
• 缺点： 分离效率较低，不适用挥发性试
19:59:33
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优点：
a. 条件温和 b.操作简便 c. 损失少回收率高 d. 层析 柱可反复使用
凝胶的类型：
Sephadex: 交联葡聚糖
G-10
G-15
G-25
G-50
G-75
G-100
G-150
G-200
吸水量
1.0
1.5
2.5
5.0
7.5
10.0
（g/g干凝 胶）
工作范围 （肽与蛋 白）D
样分离。定性定量不便。 • 应用：平板色谱法在染料、农药、医药、 有机酸碱类化合物、糖类化合物、氨基酸、 蛋白质及中草药中有效成分的分离分析中经 常被使用。也可以用于无机离子的分离。还 经常作为高效液相色谱的一种预试方法。
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柱层析
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柱层析：是吸附色谱的一种，它利用吸附剂对不同物 质吸附能力的差异，用溶剂将混合物的组分逐一洗 脱分离的一种分离方法。