生物化学分子生物学经典实验技术

PCR

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的DNA 片段。可看作生物体外的特殊DNA复制。

DNA聚合酶（DNA polymerase I）最早于1955年发现，而较具有实验价值及实用性的Klenow fragment of E. Coli 则是于70年代的初期由Dr. H. Klenow 所发现，但由于此酶不耐高温，高温能使之变性, 因此不符合使用高温变性的聚合酶链式反应。现今所使用的酶(简称Taq polymerase), 则是于1976年从温泉中的细菌（Thermus aquaticus）分离出来的。它的特性就在于能耐高温，是一个很理想的酶，但它被广泛运用则于80年代之后。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，它是于1971年由Dr. Kjell Kleppe 提出。他发表了第一个单纯且短暂性基因复制（类似PCR前两个周期反应）的实验。而现今所发展出来的PCR则于1983由Dr. Kary B. Mullis发展出的，Dr. Mullis当年服务于PE公司，因此PE公司在PCR界有着特殊的地位。Dr. Mullis 并于1985年与Saiki 等人正式表了第一篇相关的论文。此后，PCR 的运用一日千里，相关的论文发表质量可以说是令众多其它研究方法难望其项背。随后PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，成为分子生物学研究的最重要技术。Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR原理

DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链，在DNA聚合酶与启动子的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。在实验中发现，DNA 在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性

和复性，并设计引物做启动

子，加入DNA聚合酶、dNTP

就可以完成特定基因的体外

复制。

但是，DNA聚合酶在高温时

会失活，因此，每次循环都得

加入新的DNA聚合酶，不仅

操作烦琐，而且价格昂贵，制

约了PCR技术的应用和发

展。

发现耐热DNA聚合同酶--Taq

酶对于PCR的应用有里程碑

的意义，该酶可以耐受90℃

以上的高温而不失活，不需要

每个循环加酶，使PCR技术

变得非常简捷、同时也大大降

低了成本，PCR技术得以大

量应用，并逐步应用于临床。

PCR反应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ PCR步骤

标准的PCR过程分为三步：

1.DNA变性（90℃-96℃）：双链DNA模板在热作用下，氢键断裂，形成单链DNA

2.退火（25℃-65℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部双链。

3.延伸（70℃-75℃）：在Taq酶（在72℃左右最佳的活性）的作

用下，以dNTP为原料，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互

补的DNA链。

每一循环经过变性、退火和延伸，DNA含量既增加一倍。

现在有些PCR因为扩增区很短，即使Taq酶活性不是最佳也能在

很短的时间内复制完成，因此可以改为两步法，即退火和延伸同时在60℃-65℃间进行，以减少一次升降温过程，提高了反应速度。

PCR检测

PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势

PCR反应特点

特异性强

PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。

其中引物与模板的正确结合是关键。引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对原则的。聚合酶合成反应的忠实性及Taq DNA聚合酶耐高温性，使反应中模板与引物的结合(复性)可以在较高的温度下进行，结合的特异性大大增加，被扩增的靶基因片段也就能保持很高的正确度。再通过选择特异性和保守性高的靶基因区，其特异性程度就更高。

灵敏度高

PCR产物的生成量是以指数方式增加的，能将皮克(pg=10- 12)量级的起始待测模板扩增到微克(ug=-6)水平。能从100万个细胞中检出一个靶细胞；在病毒的检测中，PCR的灵敏度可达3个RFU(空斑形成单位)；

在细菌学中最小检出率为3个细菌。

简便、快速

PCR反应用耐高温的Taq DNA聚合酶，一次性地将反应液加好后，即在DNA扩增液和水浴锅上进行变性-退火-延伸反应，一般在2～4 小时完成扩增反应。扩增产物一般用电泳分析，不一定要用同位素，无放射性污染、易推广。

对标本的纯度要求低

不需要分离病毒或细菌及培养细胞，DNA 粗制品及RNA均可作为扩增模板。可直接用临床标本如血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等DNA扩增检测。

双向电泳

双向电泳（two-dimensional electrophoresis）

是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE （按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维

分布的蛋白质图。

双向电泳完整的操作步骤

（一）第一向等电聚焦

1. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的水化上样缓冲液

（I）（不含DTT，不含Bio-Lyte）一小管（1ml/

管），置室温溶解。

2. 在小管中加入0.01g DTT，Bio-Lyte 4-6、5-7

各2.5ml，充分混匀。

双向电泳图谱

3. 从小管中取出400ml水化上样缓冲液，加入100ml样品，充分混匀。

4. 从冰箱中取-20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17cm pH

4-7），室温中放置10分钟。

5. 沿着聚焦盘或水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品。

在槽两端各1cm左右不要加样，中间的样品液一定要连贯。