实验室污染防治讲解学习
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PCR污染的产生及防治
分子生物学技术平台讨论会 ——PCR系列之一 2008-2-28
PCR污染的监测
• PCR强大扩增能力+检测的敏感性 • 经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍 • 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题
NTC (No Template Control): 必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对 照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。
• 准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。
• 选择质量好的Eppendorf管--密封性好且开管不需要太大力气
• 打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作 要轻，以防管内液体溅出。
• 实验结束后及时清理台面
防止PCR污染
移液器操作
由于操作时不慎将模板吸入枪内 或粘上枪头是一个严重的污染源， 因而加样时要十分小心。
• Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi:10.1101/pdb.top14
wenku.baidu.com
讨论
• 设置-RT对照后是不是可以不用设NTC了？ • 使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？ • ……
引起PCR污染的原因
➢ 实验室中克隆质粒的污染
• 克隆质粒浓度高, 另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂, 其污 染可能性也很大
防止PCR污染
首要原则 • 永远要设置NTC对照
如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的 后果：一大段时间的数据不可信
• 准备PCR的移液器要专用 千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备 PCR 体系
UNG：50摄氏度，2分 钟，作用于含有dU 的DNA双链或单链
然后开始PCR反应的预 变性步骤，同时 UNG失活
※对于不含dU的PCR产物无效
出现污染后解决办法
• 更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用
• 清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸
1）准备PCR的移液器专用
2）吸样要慢，吸样时尽量一次性 完成，忌多次抽吸，切勿形成喷 雾，以免交叉污染或产生气溶胶 污染。
3）最好在加完所有其他反应成分 后才吸加模板。
4）推荐在准备PCR过程中使用滤 芯枪头
防止PCR污染
• 选用含UNG（尿嘧 啶DNA糖基酶 Uracil-NGlycosylase)的试 剂，有助于防止PCR 产物引起的污染。
防止PCR污染
空间：
合理分隔实验区域:将样品的处理、配制PCR反应液、 PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特 别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严 格分开。
理想状态：
各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区
域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或RNA。
防止PCR污染
操作
• 一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并 应勤于更换。
常见的PCR contamination
• 常规PCR
1
23
4
5
6
7
8 9 NTC
• 荧光定量PCR
NTC
引起PCR污染的原因
➢ 模板间交叉污染
• 容器被污染 • 模板放置时, 由于密封不严溢于容器外 • 容器外粘有模板而造成相互间交叉污染 • 模板吸取过程中, 因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污
染，从而导致交叉污染
引起PCR污染的原因
➢ PCR试剂污染
• PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR 核酸模板污染。
引起PCR污染的原因
➢ PCR产物污染-最主要最常见
• PCR 产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染, 就可形成假阳性。
• 移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mix
钠溶液擦拭清洁。 2）或者用10%漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间最好过夜。
• 实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法
参考文献
• Kwok S ,Higuchi R. Avoiding false positives with PCR[J ] . Nature ,1989 ,339 (6221) :237 - 238.
• PCR产物的气溶胶污染： 一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝
※气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态 散体系。 空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈 地摇动反应管, 开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可 形成气溶胶
分子生物学技术平台讨论会 ——PCR系列之一 2008-2-28
PCR污染的监测
• PCR强大扩增能力+检测的敏感性 • 经30个周期后，特定DNA片段的数量在理论上可增加109倍 • 极微量的污染便可导致假阳性，尤其对定量造成很大的问题
NTC (No Template Control): 必须设置一个不含模板DNA但含有PCR系统中所有其他成分的对 照反应，这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加。
• 准备专供自己使用的PCR试剂，分装为小份。不要与样品存放在一起。
• 选择质量好的Eppendorf管--密封性好且开管不需要太大力气
• 打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部。开管动作 要轻，以防管内液体溅出。
• 实验结束后及时清理台面
防止PCR污染
移液器操作
由于操作时不慎将模板吸入枪内 或粘上枪头是一个严重的污染源， 因而加样时要十分小心。
• Mifflin T.E. Setting Up a PCR Laboratory. CSH Protocols; 2007; doi:10.1101/pdb.top14
wenku.baidu.com
讨论
• 设置-RT对照后是不是可以不用设NTC了？ • 使用了滤芯枪头，是否不需要移液器专用了？ • ……
引起PCR污染的原因
➢ 实验室中克隆质粒的污染
• 克隆质粒浓度高, 另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂, 其污 染可能性也很大
防止PCR污染
首要原则 • 永远要设置NTC对照
如果不能在污染出现的第一时间发现，会导致严重的 后果：一大段时间的数据不可信
• 准备PCR的移液器要专用 千万不能用吸取PCR产物/克隆质粒的移液器去准备 PCR 体系
UNG：50摄氏度，2分 钟，作用于含有dU 的DNA双链或单链
然后开始PCR反应的预 变性步骤，同时 UNG失活
※对于不含dU的PCR产物无效
出现污染后解决办法
• 更换试剂 更换新的试剂和水，用确保无污染的移液器分装备用
• 清洁所有可能的污染源：实验台面、小离心机、冰箱门把手等等 1）实验台面、超净工作台用现配的3%双氧水或10%次氯酸
1）准备PCR的移液器专用
2）吸样要慢，吸样时尽量一次性 完成，忌多次抽吸，切勿形成喷 雾，以免交叉污染或产生气溶胶 污染。
3）最好在加完所有其他反应成分 后才吸加模板。
4）推荐在准备PCR过程中使用滤 芯枪头
防止PCR污染
• 选用含UNG（尿嘧 啶DNA糖基酶 Uracil-NGlycosylase)的试 剂，有助于防止PCR 产物引起的污染。
防止PCR污染
空间：
合理分隔实验区域:将样品的处理、配制PCR反应液、 PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区进行，特 别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严 格分开。
理想状态：
各个区域实验用品及移液器专用，实验前应将该区
域用紫外线消毒，破坏残留的DNA或RNA。
防止PCR污染
操作
• 一旦进入吸加PCR试剂的专用场所并开始工作，就应戴上一副新手套，并 应勤于更换。
常见的PCR contamination
• 常规PCR
1
23
4
5
6
7
8 9 NTC
• 荧光定量PCR
NTC
引起PCR污染的原因
➢ 模板间交叉污染
• 容器被污染 • 模板放置时, 由于密封不严溢于容器外 • 容器外粘有模板而造成相互间交叉污染 • 模板吸取过程中, 因气溶胶（aerosol）或其他原因引起移液器污
染，从而导致交叉污染
引起PCR污染的原因
➢ PCR试剂污染
• PCR 试剂配制过程中, 移液器、容器、水等原因造成试剂被PCR 核酸模板污染。
引起PCR污染的原因
➢ PCR产物污染-最主要最常见
• PCR 产物拷贝量大，极微量的PCR产物污染, 就可形成假阳性。
• 移液器吸取PCR产物进行电泳检测，同一支移液器去准备PCR mix
钠溶液擦拭清洁。 2）或者用10%漂白粉溶液擦拭 3) 紫外光照射，照射距离应不超过90 cm，照射时间最好过夜。
• 实验过程中更加小心，采用前面提到的各种防止污染的办法
参考文献
• Kwok S ,Higuchi R. Avoiding false positives with PCR[J ] . Nature ,1989 ,339 (6221) :237 - 238.
• PCR产物的气溶胶污染： 一个气溶胶颗粒可能含几万个拷贝
※气溶胶（aerosol）：悬浮于气体介质中粒径一般为 0.001μm~1000μm的固体、液体微小粒子形成的胶溶状态 散体系。 空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶, 在操作时比较剧烈 地摇动反应管, 开盖时、吸样时及移液器的反复吸样都可 形成气溶胶