生物信息学软件及使用技巧

引物设计要点
► 可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模
板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率 高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好 高，错误引发的引发率一般不要高过100，最好 没有错误引发位点，如此可以保证不出非目的 产物的假带。 ► 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5， 引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5， 否则容易产生引物二聚体带，且会降低引物浓 度从而导致PCR正常反应不能进行。 度从而导致PCR正常反应不能进行。 ► 对引物的修饰一般是增加酶切位点，应参考载 体的限制酶识别序列确定，常常对上下游引物 修饰的序列选用不同限制酶的识别序列，以有 利于以后的工作。
structure
analysis topology prediction. prediction. ► 软件。如，Vecotr NTI, Antheprot 软件。如，Vecotr
Omiga 2.0 ORF Map
三、限制性酶切位点分析
定义：一种能识别特殊，短核苷酸序列，并在DNA 定义：一种能识别特殊，短核苷酸序列，并在DNA
二、分析mRNA开放读框 二、分析mRNA开放读框
分析步骤： 分析步骤：
► 获得尽量长的mRNA序列。 获得尽量长的mRNA序列。
► 分析可能的读框（六种）。
软件：Vector NTI， 软件：Vector NTI， Omiga 等。 在线: 在线:
/tools/dna.html） （/tools/dna.html）
引物设计要点
► 一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18一般引物的长度为16-23bp，常用的长度为18-
21bp，过长或过短都不合适。 21bp，过长或过短都不合适。 ► 引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发 引物3 端的碱基一般不用A，因为A 位点的引发效率相对比较高，而其它三种碱基 的错误引发效率相对小一些。 ► 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都 引物的GC含量一般为45-55%，过高或过低都 不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相 不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相 差太大。 ► 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右， 引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃ 当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可 当然由于模板序列本身的组成决定其Tm值可 能偏低或偏高，可根据具体情况灵活运用。
Cn3D 2.5 显示 1EQF A链三维结构 A链三维结构
十一、质粒绘图
► winplas ► Plasmid
processor ► DMUP beta ► Vector NTI
Winplas 2.6 质粒构建
七、DNA与蛋白质序列同源分析 七、DNA与蛋白质序列同源分析
（进化树构建）
不同情况： 不同情况：
Bioinformatics Basics
生物信息学软件及 使用技巧
吴元明 讲师
第四军医大学基础部 wuym@
生物信息学软件分类
► 单机分析软件：如winplas ► 在线分析软件: 如webcutter 在线分析软件: ► 生物学数据库: 如NCBI,DDBJ,EBI 生物学数据库:
Vector NTI 5.2 ---
contig Express
二、分析mRNA开放读框 二、分析mRNA开放读框
► （一)5’-UTR结构 （一)5’ UTR结构
1、mRNA5’端m7G帽有增强翻译水平的作用． mRNA5’ m7G帽有增强翻译水平的作用． 2、“上游AUG密码子”(位于起始AUG上游的其他AUG 上游AUG密码子” 位于起始AUG上游的其他AUG 密码子) 密码子)的存在往往抑制下游开放读框的翻译效率． 3、起始AUG旁侧序列对翻译效率的影响． 、起始AUG旁侧序列对翻译效率的影响． Kozak序列：GCCAUGG Kozak序列：GCCAUGG ► (二)3’-UTR结构 )3’ UTR结构 1．poly(A)尾增加翻译效率 poly(A)尾增加翻译效率 2．富含UA序列抑制翻译。 ．富含UA序列抑制翻译。
引物设计要点
► ∆G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个 ∆G值反映了引物与模板结合的强弱程度，也是一个
重要的引物评价指标。 ► 一般情况下，在Oligo 5.0软件的∆G值窗口中，引物 一般情况下，在Oligo 5.0软件的∆G值窗口中，引物 的∆G值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间部分 ∆G值最好呈正弦曲线形状，即5 ∆G值较高，而3 ∆G值相对较低，且不要超过9 ∆G值较高，而3’端∆G值相对较低，且不要超过9 （∆G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正 ∆G值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正 确引发反应而可防止错误引发。 ► 其原理，引物与模板应具有较高的结合能量，这样 有利于引物与模板序列的整合，因此5 有利于引物与模板序列的整合，因此5’端与中间段 的∆G值应较高，而3’端∆G值影响DNA聚合酶对模 ∆G值应较高，而3 ∆G值影响DNA聚合酶对模 板DNA的解链，过高则不利于这一步骤。 DNA的解链，过高则不利于这一步骤。
分析步骤： 分析步骤：
► 找到待分析的核酸序列。
► 利用Vector 利用Vector
NTI或其他软件分析。 NTI或其他软件分析。
注 意：
•DNA模拟电泳具有一定实验预示功能。 DNA模拟电泳具有一定实验预示功能。 DNA模拟电泳具有一定实验预示功能
•模拟电泳不能作为实验结果或依据。 模拟电泳不能作为实验结果或依据。 模拟电泳不能作为实验结果或依据
一、DNA 一、DNA 序列片断拼接（电子基因克隆）
► 获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有 获得感兴趣的EST，在dbEST数据库中找出EST的最有 dbEST
途径是寻找同源序列，标准：长度≥100bp，同源性 途径是寻找同源序列，标准：长度≥100bp，同源性 50%以上、85%以下。 50%以上、85%以下。 ► 然后将检出序列组装为重叠群（contig），以此重 然后将检出序列组装为重叠群（contig） 叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装， 叠群为被检序列，重复进行BLAST检索与序列组装， 延伸重叠样系列，重复以上过程，直到没有更多的 重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时 重叠EST检出或者说重叠群序列不能继续延伸，有时 可获得全长的基因编码序列。 ► 再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如有 再与GeneBank核酸数据库进行相似性检测，假如有 精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻 精确匹配基因，将EST序列数据据EST六种阅读框翻 译成蛋白质，接着与蛋白质序列数据库进行比较分 析。
► 利用Vector 利用Vector
NTI软件分析。 NTI软件分析。
► 利用webcutter 利用webcutter
2.0在线分析。 2.0在线分析。 /cutter） （/cutter）
四、DNA模拟电泳 四、DNA模拟电泳
的某些位点上切割的蛋白质。细菌包含了400种 的某些位点上切割的蛋白质。细菌包含了400种 这样的酶，能识别和切割100种以上不同的DNA序 这样的酶，能识别和切割100种以上不同的DNA序 列。
如：EcoRI 识别序列
GAATTC GTTAAC
三、限制性酶切位点分析
分析步骤： 分析步骤：
► 找到待分析的核酸序列。
• 个体与数据库比较。
• 两个或两个以上个体比较。
分析方法： 分析方法：
► internet网络。如，NCBI的BLAST; internet网络。如，NCBI的BLAST;
ExPASy的Alignment. ExPASy的Alignment.
► 软件。如，Vecotr 软件。如，Vecotr
NTI
Bioinformatics Basics
生物信息学软件的意义
1. 分析和处理实验数据和公共数据，加快研 究进度，缩短科研时间。 2. 提示、指导、替代实验操作，利用对实验 数据的分析所得的结论设计下一阶段的实 验。 3. 用计算机管理实验数据。
Bioinformatics Basics
生物学软件常用功能（核酸类）► Nhomakorabea选取最可能的一种。看是否符合各种条 件。
目前应用的蛋白质结构预测的算法
1. 2. 3.
同源预测(一级结构决定高级结构) 同源预测(一级结构决定高级结构) 结构与结构相对比（DALI算法） 结构与结构相对比（DALI算法） 当前最先进的结构预测方法： 结构类识别（fold recognition） 结构类识别（fold recognition） 先建立一个已知的结构类数据库（fold 先建立一个已知的结构类数据库（fold library)，将待测序列“穿过”该数据库构成的座 library)，将待测序列“穿过”该数据库构成的座 标，并根据事先确定的物理限制，逐个位置移动 （threading， sequence-structure alignment) ，并 threading， sequence一个函数（sequence一个函数（sequence-structure fitness alignment) 判断序列与结构类的符合程度，找出未知序列在 目标结构上的能量最优和构象最稳固的比对位置。 对计算机要求很高。
DNA 序列片断拼接----Contig Express 序列片断拼接----Contig 分析mRNA开放读框 分析mRNA开放读框 限制性酶切位点分析 DNA 模拟电泳 PCR 引物设计 RNA二级结构分析 RNA二级结构分析
Bioinformatics Basics
生物学软件常用功能（蛋白类）
Vector NTI Suit 5.5 模拟电 泳
Gene Construction Kit 2.0 模 拟电泳
五、PCR 五、PCR 引物设计（杂交探针设计）
引物设计的原则
1. 2.
引物要跟模板紧密结合； 引物与引物之间不能有稳定的二聚体或 发夹结构存在；
3.
引物不能在别的非目的位点引起高效 DNA聚合反应(即错配) DNA聚合反应(即错配)。
引物设计需要考虑的因素 引物设计需要考虑的因素
如： ► 引物长度（primer length）， 引物长度（primer length）， ► 产物长度（product length）， 产物长度（product length）， ► 序列Tm值 序列Tm值 (melting temperature)， temperature)， ► ∆G值 ∆G值(internal stability)， stability)， ► 引物二聚体及发夹结构（duplex 引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）， hairpin）， ► 错误引发位点（false 错误引发位点（false priming site）， site）， ► 引物及产物GC含量（composition），有时 引物及产物GC含量（composition），有时 还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引 进突变等。
Vector NTI Suit AlignX 同源比较—主 同源比较— 窗口
Vector NTI Suit 同源比较—进化树 同源比较—
八、蛋白质一级结构分析
包括： 包括：
• • • • 氨基酸组成。 氨基酸组成。 PI MW 亚细胞定位
分析方法： 分析方法：
► internet网络。如，ExPASy的primary internet网络。如，ExPASy的
蛋白一级结构分析（氨基酸分析） 蛋白二级结构分析（结构域分析） 蛋白三级结构分析（空间结构分析）
Bioinformatics Basics
生物学软件常用功能（共同类）
DNA、蛋白质序列同源分析 DNA、蛋白质序列同源分析 进化树构建
生物学软件常用功能（其它类） 生物学软件常用功能（其它类）
质粒绘图类 图象处理软件