考马斯亮蓝染色的原理和方法
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考马斯亮蓝染色的原理和方法
在蛋白质染色方法中,目前以考马斯亮蓝染色最为常用。
因为它既克服了氨基黑染色灵敏度不高的限制,又比银染简便易操作。
考染的历史
考马斯亮蓝染色最早由Fazekas等在1963年用于醋酸纤维素膜电泳,并认为同样可用于纸电泳,琼脂糖电泳和淀粉凝胶电泳。
1965年Meyer等将此方法应用于聚丙烯酰胺凝胶电泳。
考染的灵敏度
考马斯亮蓝染色可以达到0.2~0.5 μg(200~500 ng),最低可检出0.1 μg蛋白;银染的灵敏度比考染高将近100倍,最低可以检出2 ng蛋白。
通过考染条带的深浅粗细,可以大致判断该条带有多少蛋白,如在8.6×6.8 cm(W×L)?.75 mm厚的胶上15~20 μg蛋白大约是下面这样的条带:
考马斯亮蓝染料的种类
考马斯亮蓝分为R-150、R-250、R-350、G-250等。
其中R-350最为灵敏,R为红蓝色,G 为绿蓝色。
R-250即三苯基甲烷,每个分子含有两个SO3H基团,偏酸性,与氨基黑一样也是结合到蛋白质的碱性基团上。
G-250即二甲花青亮蓝,是一种甲基取代的三苯基甲烷。
推荐一种考染的方法
⑴电泳后的凝胶立即浸泡在固定液(500 ml 乙醇,100 ml 冰醋酸,400 ml 蒸馏水)中至少30 min,如有必要可在固定液中浸泡过夜;
⑵将固定后的凝胶在热的染色液(0.29 g 考马斯亮蓝溶解在250 ml 脱色液中,在使用前边搅拌边加热至60℃)中浸泡10min,然后用蒸馏水将凝胶淋洗一次;
⑶多次变换脱色液(250 ml 乙醇,80 ml冰醋酸,加蒸馏水至1 L),直至凝胶背景脱净为止,为加快脱色,可略加温度;以上各步最好用振荡器(摇床)震荡染色皿。
⑷为了防止凝胶干燥后的龟裂,脱去背景色的凝胶在保存液(25 ml 87% 甘油加225 ml 脱色液)中浸泡30min。
然后将凝胶放在玻璃板上,再用保存液浸湿玻璃纸包住凝胶在室温下晾干。
需要声明一点,考马斯亮蓝染色的方法不是唯一的,你可以参考几种之后总结一个适合自己的方案出来。