基因重组与基因工程

其他
斑点印迹 (dot blotting) 原位杂交 (in situ hybridization) DNA点阵 (DNA array)
DNA芯片技术 (DNA chip)
三 种 印 迹 技 术 的 比 较
②
①
③
分子杂交实验
放 射 自 显 影 照 片
DNA 点阵
第二节 聚合酶链式反应
Polymerase Chain Reaction（PCR)
有同源的核酸分子存在。
二、印迹技术的类别及应用
1、DNA印迹技术 (Southern blotting)
用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体 的分析。
2、RNA印迹技术 (Northern blotting)
用于RNA的定性定量分析。
3、蛋白质的印迹分析 (Western blotting)
用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
二、定位克隆
定义
从一种致病基因的染色体定位出发逐步缩 小范围，最后克隆该基因。
系统的定位克隆工作
① 遗传学分析(确定致病基因染色体定位)
交换分析、连锁不平衡分析 ② 分子生物学分析 染色体异常(缺失、易位等)分析、基因 文库的筛选与基因克隆
三、非定位候选基因克隆策略
由于基因组作图的完成和分子病理学的发 展，人们可以不依靠染色体定位，直接根据病
第一轮筛选
第二轮筛选
第三轮筛选
第五节 疾病相关基因的克隆
与鉴定
Cloning and Identification of Disease Relative Genes
克隆疾病相关基因的策略
一、功能性克隆(functional cloning) 二、定位克隆(positional cloning) 三、非定位候选基因克隆策略(positionindependent candidate gene approaches) 四、定位候选基因克隆策略(positional candidate gene approaches )
14 基因重组与基因工程
Chapter 14 gene recombination and genetic engineering
第一节 分子杂交与印迹技术
Molecular Hybridization & Blotting Technology
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在DNA复性过程中，如果把不同DNA单链 分子放在同一溶液中，或把DNA与RNA放在一
理学变化和对各种基因产物功能的了解，预测
出候选致病基因。
四、定位候选基因克隆策略
当致病基因的染色体定位确认后，人们可 以利用因特网上的基因网站所提供基因序列数
据，鉴定出候选致病基因。
第六节 遗传修饰动物模 型的建立及应用
The Establishment and Application of Heredity-Modified Animal Model
1．质粒： 是存在于天然细菌体内的一种独立于细 菌染色体之外的双链环状DNA，具有 独立复制的能力，通常带有细菌的抗药 基因。 最 早 使 用 的 质 粒 DNA 是 人 工 构 建 的 pBR322，该质粒分子大小为4.3kb， 带有抗四环素和抗氨苄青霉素基因，含 EcoRⅠ，BamHⅠ，HindⅢ等单一的 限制酶切点。
一、载体和目的基因的分离
为了进行基因重组，首先需要对载 体DNA和目的基因分别进行分离纯化， 得到其纯品。 （一）载体： 基因工程中常用的载体(vector)主要包 括质粒(plasmid)、噬菌体(phage)和 病毒(virus)三大类。这些载体均需经人 工构建，除去致病基因，并赋予一些新 的功能，如有利于进行筛选的标志基因、 单一的限制酶切点等。
蛋白质之间相互作用研究的重要性
蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形 成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成 者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制
与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢
等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。
常用蛋白质相互作用的研究技术
酵母双杂交 各种亲和分析（亲和色谱、免疫共沉淀等） 荧光共振能量转换效应分析 噬菌体显示系统筛选等等
DNA自动测序结果举例
第四节 基因文库
Gene Library
基因文库 (gene library)
是指一个包含了某一生物体全部DNA序列 的克隆群体。
•基因组DNA文库 (genomic DNA library) •cDNA文库 (cDNA library)
基因组 DNA文库
基因组文库筛选结果举例
一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法)
基本原理
基于某些化学试剂可以使DNA链在1个或2个
碱基处发生专一性断裂的特性，精确地控制反应
强度，使一个断裂点仅存在于少数分子中，不同
分子在不同位点断裂，从而获得一系列大小不同
的DNA片段，将这些片段经电泳分离。 分析前，用同位素标记DNA的5´末端，经放
二、蛋白质芯片
蛋白质芯片(protein chip)
是将高度密集排列的蛋白分子作为探针点 阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反
应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统
对靶蛋白进行定性和定量分析的一种技术。
第八节蛋白质相互作用研究技术
Research Technology of Interaction of Protein


将某一种基因DNA用适当的限制酶切断后，与 载体DNA重组，再全部转化宿主细胞，得到含 全 部 基 因 组 DNA 的 种 群 ， 称 为 G 文 库 (genomic DNA library)。 将某种细胞的全部mRNA通过逆转合成cDNA， 然后转化宿主细胞，得到含全部表达基因的种 群，称为C-文库(cDNA library)。C-文库具 有组织细胞特异性。
质粒pUC19的分子结构
2．噬菌体：

可通过转染方式将其 DNA 送 入 细 菌 体 内 进 行 增殖。常用的为人工构建 的λ 噬菌体载体。噬菌体 两端的片段对于其包装是 必需的，因而应予保留； 而其中间部分则可进行改 造或置换，使之具有某种 单一的限制酶切点。目的 基 因 与 噬 菌 体 DNA 进 行 重组时，可采用插入重组 方式，也可采用置换重组 方式。
五、几种重要的PCR衍生技术
1、反转录PCR技术 2、原位PCR技术 3、实时PCR技术
实时PCR技术原理
第三节 核酸序列分析
Nucleic Acid Sequence Analysis
核酸序列分析的基本原理 化学裂解法 (Maxam-Gillbert法) DNA链的末端合成终止法 (sanger法)
一、酵母双杂交技术的基本原理
二、酵母双杂交系统的应用
1、分析已知蛋白之间的相互作用 2、对蛋白质功能域的分析 3、分析未知蛋白相互作用 4、绘制蛋白质相互作用系统图谱 5、在药物设计中的应用
第九节 重组DNA技术


重 组 DNA 技 术 又 称 为 基 因 工 程 （genetic engineering）或分子克隆 (molecular cloning)。 基因工程的操作过程主要由以下步骤组 成：①载体和目的基因的分离；②载体 和目的基因的切断；③载体和目的基因 的重组；④重组DNA的转化和扩增；⑤ 重组DNA的筛选和鉴定。
3.从mRNA合成cDNA： 采用一定的方法 钓 取 特 定 基 因 的 mRNA ， 再 通 过 逆 转 录酶催化合成其互补 DNA （ cDNA ） ， 除 去 RNA 链 后 ， 再 用 DNA聚 合酶合成其互 补DNA 链，从而得到 双链DNA。这一方法 通常可得到可表达的 完整基因。
4．从基因文库中筛选：
3．病毒： 常用的为SV40，通过感染方式将其 DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目 前应用相对较少。
（二）目的基因： 目的基因的筛选和分离可采用以下方法进行： 1．直接从染色体DNA中分离： 仅适用于原核生物基因的分离，较少采用。
2．人工合成： 根据已知多肽链的氨基酸顺序，利用遗 传密码表推定其核苷酸顺序再进行人工 合成。适应于编码小分子多肽的基因。
一、基本工作原理
Template DNA
5 5
5
Primer 1 5 Primer 2
Cycle 1
5 5 5
5
Cycle 2
5 5 5 5
5
5
5 5
Cycle 3
5 5 5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
5 5
25～30 次循环后，模板DNA的含量 可以扩大100万倍以上。
使之发育成个体，即克隆(clone)。
三、基因剔除技术
基因剔除技术
也称基因靶向(gene targeting)灭活， 有目的去除动物体内某种基因的技术。
四、基因转移和基因剔除技术在 医学中的应用
建立动物模型
① 单基因决定疾病模型 基因剔除 获得性突变(gain-of-function mutation)
射自显影即可在X胶片上读出DNA链的序列。
二、DNA链末端合成终止法
三、DNA自动测序
采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA 序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四 种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反
应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，
通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光 分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集 荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
基因组文库的制作
5．利用PCR合成： 如已知目的基因两端 的序列，则可采用聚 合 酶 链 反 应 （polymerase chain reaction,PCR ） 技 术 ， 在体外合成目的基因。 但此法可能会造成克 隆的目的基因碱基序 列的改变。
二、载体和目的基因的切断



通 常 采 用 限 制 性 核 酸 内 切 酶 (restriction endonuclease)，简称限制酶，分别对载体 DNA和目的基因进行切断，以便于重组。 限制酶目前已经发现400多种，所识别的顺序 往往为4-8个碱基对，且有回文结构。 由限制酶切断后的末端可形成平端、3'-突出 粘性末端和5'-突出粘性末端三种情况。形成 粘 性 末 端 (cohesive end) 者 较 有 利 于 载 体 DNA和目的基因的重组。
一、转基因技术
转基因技术
采用基因转移技术使目的基因整合入受精 卵细胞或胚胎干细胞，然后将细胞导入动物子 宫，使之发育成个体。百度文库转基因——被导入的目的基因 转基因动物(transgenic animal)
——目的基因的受体动物
二、核转移技术
核转移技术
即动物整体克隆技术，将动物体细胞
核全部导入另一个体的去胞核的受精卵内，
一、功能性克隆
定义 从对一种致病基因的功能的了解出发， 克隆该致病基因。 应用 生化机制已明确、基因表达产物较易 得到部分纯化的遗传性疾病。
克隆方式
① 利用特异性抗体筛选表达型cDNA文库；
② 根据已知的部分氨基酸序列合成寡核苷酸作探 针，筛选cDNA文库。 功能互补试验 (functional complementation assay) 利用酵母系统从功能学角度鉴定致病基因。
二、PCR体系基本组成成分

模板DNA 特异性引物 耐热DNA聚合酶 dNTPs Mg2+
三、PCR的基本反应步骤
变性
95˚C
延伸 72˚C
退火
Tm-5˚C
四、PCR的主要用途
1、目的基因的克隆
2、基因的体外突变
3、DNA和RNA的微量分析 4、DNA序列测定 5、基因突变分析
起，只要在DNA或RNA的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
复性
RNA
DNA
1、印迹技术 2、探针技术
探针 (probe)
一小段用同位素、生物素或荧光染料标
标记其末端或全链的已知序列的多聚核苷酸，
与固定在NC膜上的核苷酸结合，判断是否
② 多基因决定疾病模型
第七节 生物芯片技术
Biological Chip Technology
一、基因芯片
基因芯片(gene chip)
•DNA芯片(DNA chip) •cDNA芯片(cDNA chip) 是指将许多特定的DNA片段或cDNA片 段作为探针，有规律地紧密排列固定于单位
面积的支持物上 。