GST纯化蛋白

表达纯化GST融合蛋白

（准备工作：灭离心管上面没有刻度，有塞子的管子。很小的三角烧瓶，用锡箔纸封口）（1）已经转化的菌液，或者重新转化BL21（DE3）pLysS

（2）活化：取20μl菌液加入11ml LB（Amp r）（500倍稀释），37°C，250rpm，过夜（16 h）

（3）取10ml菌液加入100ml LB（Amp r）（10倍稀释）（剩余菌液4°C保存）

（4）37°C，250 rpm，1 h 10 min-1 h 20 min，OD600 0.6-0.8（OD600小于1.0即可）

（5）取1ml菌液作为诱导前对照，冰上放置

（6）加入IPTG，终浓度1 mM

（7）30°C，250rpm，诱导适当时间（预实验确定）章foxa2 16℃过夜 sirt1 25℃过夜（8）取1ml菌液作为诱导后对照，连同诱导前菌液，12000rpm，离心2min，收集菌体，加入100μl 1×SDS上样缓冲液

（9）其余菌液，分为两份，倒入50ml离心管，5000rpm，离心20 min，收集细胞

（10）每管加入8-10ml GST裂解缓冲液重悬菌体，转移小烧杯中（无气泡）注:配GST 时最后加PMSF能够减少很多泡沫。加PMSF，蛋白酶抑制剂，溶菌酶。

（11）超声破碎细胞：超声3s，间隔10s，40次左右，超声强度200-300W（冰浴）（12）将超声后菌液转移到50ml离心管中，4°C，13000rpm，离心20-30min

（13）将上清转移到1个50ml离心管中，取出50μl，加入10ul 5×SDS上样缓冲液（其余上清-80°C保存）

（14）将沉淀加入16-20ml GST裂解缓冲液（或PBS）重悬，取出50μl，加入50μl 2×SDS 上样缓冲液（其余沉淀-80°C保存）

（15）将四个样品煮沸3min，12000rpm，离心5min

（16）8-10%SDS-PAGE检测诱导、超声是否合适，30μl上样，顺序：诱导前菌体、诱导后菌体、超声后上清、超声后沉淀注：如果蛋白在沉淀中说明形成包涵体，不容易纯化。

（17）考马斯亮蓝染色

（18）电泳的同时混匀glutathione sepharose beads（4B）（mixed slurry），取200μl加入15ml离心管中（2份）

（19）加入10ml PBS，混匀，3000rpm，离心3min，弃上清

（20）加入超声后上清液，4°C轻柔摇荡60分钟（或过夜）（横放）

（21）4°C，3000rpm，离心3min

（22）10ml GST裂解缓冲液洗涤2次（冰上）GST裂解液加PMSF，ＤＴＴ，蛋白酶抑制剂。每次4℃摇床7分钟，3000rpm离心5分钟。

（23）10ml TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT）洗涤2次（冰上）

（24）弃上清，加入1倍柱床体积的TBS（含5mM MgCl2、1mM DTT、50%甘油），混匀

（25）取悬液测定蛋白浓度或SDS-PAGE(煮蛋白的时候，蛋白就会从GST珠子上掉下来离心上样时吸取上清)

（26）-20°C保存beads

（如果就是纯化蛋白不做下面的pull down就用GSH洗珠子，让其竞争性结合珠子，摇床离心取上清，蛋白要-80℃取上清，最后将上清，珠子都取出一些做考马斯亮蓝染色看看有没有将珠子从GST上洗脱下来）

[附录]

GST裂解缓冲液（前四个组分配好之后4°C保存，DTT和蛋白酶抑制剂现用现加）

配方一

配方二

、1mM DTT）