分子标记技术

新遗传资源的鉴定： 李松涛等对抗锈病的两个小冰麦进行 RAPD分析，从40个引物中筛选到一个与抗 锈基因连锁的RAPD标记。分析结果有力地 说明，小冰麦是从冰草获得抗锈基因的易 位系。
随机扩增多态性DNA(RAwenku.baidu.comD)
优点： 技术简单，实验周期短，信息量大，检测速度 快；DNA用量少； 实验设备简单，不需DNA探针， 设计引物也不 需要预先克隆标记或进行序列分析； 不依赖于种属特异性和基因组的结构，合成一
（5）许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合 体。
理想的分子标记必须达以下要求：
(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)
具有高的多态性 共显性遗传，即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和 纯合基因型 能明确辨别等位基因 遍布整个基因组 除特殊位点的标记外，要求分子标记均匀分布于整个 基因组 选择中性(即无基因多效性) 检测手段简单、快速(如实验程序易自动化) 开发成本和使用成本尽量低廉 在实验室内和实验室间重复性好(便于数据交换)。但 是，目前发现的任何一种分子标记均不能满足以所有 要求
简单序列重复SSR( Simple Sequence Repeat )，即
微卫星DNA。
以PCR为基础的分子标记技术
随机扩增多态性DNA( RAPD )；
扩增片段长度多态性 (AFLP) ；
单链构象多态性(SSCP)；
cDNA-扩增片段长度多态性(cDNA-AFLP )；
靶位区域扩增多态性(TRAP)；
与基因组DNA中的互不顺序配对，通 过DNA聚合酶的作用，能启动DNA的 合成，扩增产物经过聚丙酰胺或琼脂 糖凝胶电泳分析，经EB染色或放射线 自显影检测。这些扩增产物（DNA片 段）的多态性可以反映基因组相应区 域的多态性。
随机扩增多态性DNA(RAPD)
原理：
1.利用一个随机引物( 一般为10个碱基) 通过PCR反
DNA限制性片段多态性图谱。
RFLP

原理：
DNA
限制性内切酶酶切
电泳
转移到硝酸纤维素滤膜
同位素或非放射标记（如地高辛等）的探针杂交
胶片放射自显影，显示酶切片段大小
RFLP的应用
1.遗传学图的构建 结合RFLP连锁图， 任何能用RFLP探针检测出的基因及其 DNA片段都可以通过回交，快速有效地 进行转移。 2.基因定位 利用RFLP技术能够准确地 标记定位种质中的目标基因，结合杂交， 回交及组织培养等技术就可以快速有效的 将所需目标基因的DNA片段引入栽培品 种中，实现品种改良。
限制性片段长度多态性(RFLP)
优点

标记广泛存在于生物体内，不受组织、环境和发 育阶段的影响。

RFLP 标记的等位基因是共显性的，不受杂交的 影响，可区分纯合基因与杂合基因。

可产生的标记数目很多，可覆盖整个基因组。
限制性片段长度多态性(RFLP)
缺点

标记技术需要酶切, 对DNA 质量要求高；


RFLP 的多态性程度偏低；
分子杂交时会用到放射性同位素，对人体和环境
都有害；

探针的制备、保存和发放也很不方便； 分析程序复杂、技术难度大、费时、成本高。
2.随意扩增多态性DNA标记—RAPD
Random Amplified Polymorphismic DNA 概念：RAPD技术建立于PCR技术的基础 之上，它是利用一系列不同的随机排列碱 基顺序的寡聚核苷酸单链为引物，对所研 究的基因组DNA进行PCR扩增，这些引 物在一定的退火条件下，
应非定点地扩增DNA片段；
2.扩增片段经琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺电泳分
离；
3.溴化乙锭染色或银染等专一性染色技术即可记录
RAPD 指纹；
4.进行DNA 多态性分析。
RAPD技术流程：
RAPD分子标记的应用

RAPD技术已在苜蓿，豆类，番茄，辽东 栎，蔗糖，丁香，葡萄，番木瓜，棉花， 月季，牡丹，锦鸡儿，野大豆，桉树，玉 米，水稻等多种植物中广泛应用。
简单序列重复(SSR)
原理：
由于重复次数的不同及重复程度的不完全造成 了每个位点的多态性。
根据其两端的保守序列设计一对特异性引物，
PCR 扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳即可显示不
同基因型个体在这个SSR位点的多态性。



SSR基本步骤： (1)构建小片段或大片段的基因组。 (2)筛选阳性克隆。通过传统的影印或挑单菌落 点膜的方法，把克隆转移到尼龙膜上，经过固 定后，用标记过的序列重复寡核苷酸或含微卫 星序列的探针与尼龙膜上的克隆点杂交，筛选 出其中的阳性克隆。 (3)测序、设计引物、优化PCR反应条件，获 得的阳性克隆经过确认后，全部或经过随机挑 选后测序，然后根据微卫星序列两侧保守区域 的序列设计引物，优化PCR扩增的条件，获得 稳定、可靠的SSR标记。
5. 60年代末和70年代初,主要致力于研 究基因的体外分离技术。 6. 1980年Bostern将生物个体之间DNA 序列的差异作为标记用于遗传作图，从 此开创了在DNA水平上研究遗传变异的 新阶段。 7. 近10年来，在人类基因组研究计划的 推动下，分子标记的研究与应用得到迅 速的发展。
分子标记的历史

子中特定的位点，如果因碱基的突变、插入或缺 失，或者染色体结构的变化而导致生物个体或种 群间该酶切位点的消失或新的酶切位点的产生，
那么利用特定的限制性内切酶切割不同个体的基因 组DNA， 就可以得到长短、数量、种类不同的限制 性DNA片段，通过电泳和Southern杂交转移到硝酸 纤维素膜或尼龙膜上, 选用一定的DNA标记探针与 之杂交，放射自显影后就可得到反映个体特异性的
目前主要用于以下4个方面的研究： a：研究种质资源的亲缘关系和遗传背景。 b：种质资源（含亲本材料）的分类。 c：种质的遗传变异评价。 d:核心种质筛选。 基因连锁图的构建：Tulsieram等最早利 用RAPD标记在胚乳组织进行白石杉的遗 传学图构建，而后用相同的策略又相继 构建了湿地松、欧洲赤松、火炬松等的 遗传学图。
二
类型及原理
现已出现的分子标记技术有几十种，部 分分子标记技术所属类型如下： 建立在Southern杂交基础上的分子标记技术
限制性内切酶片段长度多态性标记(RFLP )； 染色体原位杂交(CISH)。
以重复序列为基础的分子标记技术
卫星DNA (Satellite DNA ) ；
小卫星DNA ( Minisatellite DNA ) ；

多态性(Polymorphism)－群体内同一DNA序列的
两种或多种变异形式，统计表明：群体内任何两 个生物个体平均每1000～10000个碱基对有一对有 差别，这种差别就是多态性。
3
分子标记的特点
(相对形态，细胞，生化标记具有的优点)： （1）直接以DNA的形式表现，在生物体的各个组织、各个 发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达 与否等问题； （2）数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； （3）多态性高，自然界存在许多等位变异，无须人为创造； （4）表现为中性，不影响目标性状的表达；

1.广义的分子标记(molecular marker)是指可 遗传的并可检测的DNA序列或蛋白质。 蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶 （指由一个以上基因位点编码的酶的不同分子
形式）及等位酶（指由同一基因位点的不同等
位基因编码的酶的不同分子形式）。

2.狭义的分子标记概念只是指DNA标记 能反映生物个体或种群间基因组中某 种差异特征的DNA片段，它直接反映基因 组DNA间的差异。
RAPD对反应条件相当敏感，包括模板浓度、
Mg2+浓度，所以实验的重复性差。
3、简单重复序列标记—SSR （simple sequence Repeats）
简单序列重复(SSR)即微卫星DNA
微卫星是指以少数几个核苷酸( 1~ 6 个) 为单位 多次串联重复的DNA序列。 微卫星由核心序列和两侧的保守侧翼序列构成。 保守的侧翼序列使微卫星特异地定位于染色体某 一区域，核心序列重复数的差异则形成微卫星的 高度多态性。
以单个核甘酸的变异为核心的分子标记技术
单核苷酸多态性标记(SNP)
以特定序列为核心的分子标记技术
线粒体DNA分子标记(mtDNA)
三. 几种分子标记介绍
1.限制性片段长度多态性标记 Restriction Fragment Length Polymorphism
RFLP：限制性片段长度多态性，为第一代 多态性记。 原理：限制性内切酶能识别并切割基因组DNA分
通常所说的分子标记是指以DNA多态性为 基础的遗传标记。 分子标记技术本质上都是以检测生物个 体在基因或基因型上所产生的变异来反映
基因组之间的差异。
1 分子标记发展简史
1. 1869年，瑞士医生Miescher就开始了 核酸的研究。 2. 1930年提出两种核酸(RNA和DNA)的概 念。 3. 1953年Waston和Crick提出了DNA双螺 旋结构及其半保留复制模型之后，对基 因的DNA序列及其表达和调控等方面的研 究取得了很大进展。 4. 20世纪60年代中期,从细胞中分离基因 的工作拉开了基因工程的序幕。

3.遗传多态性分析 运用RFLP技术可以 尽可能多地保存那些在已知位点上有异 态的品系，以求最大程度地保持品种的 多样性。 4.细胞质遗传研究 RFLP技术是对DNA 序列自然变异的直接检测，只需选择适 当的限制性内切酶或DNA探针作分子标记， 因而对植物不同种属或杂种后的细胞质 遗传变异及基因型的鉴定具有较高的灵 活性和灵敏性，从而能较好地应用于细 胞质遗传的研究。
分子标记的发展 . . .
HiSpeed sequ
CAPACITY
DArT SNPs Multi-SSRs SRAP, TRAP AFLPs SSRs
RAPDs
RFLPs
1985
1990
1995
2000
2

分子标记来源于DNA水平的突变
突变(Mutation)是指DNA水平的可遗传的变异，不
管这种DNA变异能不能导致可检测的表型或生化改 变，突变产生的变异是自然选择的基础，可遗传 的突变在群体中扩散从而产生多态性。
序列特征化扩增区域(SCAR)； 相关序列扩增多态性(SRAP )。
以mRNA为基础的分子标记技术
表达序列标签(ESTs) ；
差异显示(DD) ；
逆转录PCR (RT-PCR) ；
差异显示逆转录PCR (DDRT-PCR) ； 特征性差异分析(RAD) ； 基因表达系列分析(SAGE) 。
分子标记简介
主要内容
分子标记相关概念 分子标记的类型与发展 几种分子标记的应用

一 分子标记相关概念
所谓分子标记是根据基因组DNA存在
丰富的多态性而发展起来的可直接反映生
物个体在DNA水平上的差异的一类新型的
遗传标记,它是继形态学标记、细胞学标记、
生化标记之后最为可靠的遗传标记技术。
分子标记的概念有广义和狭义之分



第一代分子标记技术 RFLP （Restriction Fragment Length Polymorphism，限制性片段长度多态性） 第二代分子标记技术 RAPD（Random Amplified Polymorphic DNA， 随机扩增多态性DNA ） AFLP （Amplified Fragment Length Polymorphism，扩增片断长度多态性） 事实上，还有很多分子标记技术像SSR、ISSR、SRAP （相关序列扩增多态性）另外，还有现在号称为第三代 分子标记的SNP（ 单核苷酸多态性)
简单序列重复(SSR)
应用
是种群研究和进化生物学最常用的分子标记之 一，广泛地应用于生物杂交育种、遗传连锁图谱、 种群遗传多样性、系统发生等研究领域。
微卫星标记的优缺点：
优点：
套引物可以用于不同生物基因组分析；
用一个引物就可扩增出许多片段，几乎覆盖整
个基因组，而且不需要同位素，安全性好。
随机扩增多态性DNA(RAPD)
缺点：实验的稳定性和重复性差
显性遗传，不能识别杂合子位点，这使得遗 传分析相对复杂，在基因定位、作连锁遗传图 时，会因显性遮盖作用而使计算位点间遗传距 离的准确性下降；