血浆中药物分析实验-第一部分

举例：常用的去除蛋白质的方法
加入与水相混溶的有机溶剂
• 常用有机溶剂:乙腈、甲醇、丙酮、四氢呋喃。
• 血样与溶剂体积比—1：（ 1~3 ） ，可除去90%以上蛋白 质。 • 高速离心分离（12000r/min ）—离心1~2min，可以将析出 的蛋白质完全沉淀。
• 注意：普通离心机（3000r/min）不能将蛋白质沉淀完全。
上交讨论结果）：
1. 为什么要进行地高辛血药浓度监测？
2. 影响地高辛疗效的因素有哪些？
• 一、生物样品中药物分析的性质和意义
• 二、生物样品中药物分析的对象和特点 • 三、生物样品的种类 • 四、生物样品分离、纯化与浓集
• 二、生物样品中药物分析的对象和特点
• （一）生物样品中药物分析的对象 • （二）生物样品中药物分析的特点
（一）生物样品预处理的目的
• ①使药物从缀合物及结合物中释放 – 测定药物的总浓度
• ②使样品纯化
– 消除生物基质中内源性物质的干扰
• ③提高检测灵敏度
– 适应和符合测定方法要求的灵敏度 • ④防止分析仪器的污染 – 提高分析仪器的耐受程度、改善分析结果
①使药物从缀合物及结合物中释放
• 药物在体内存在形式：
物分析，是随着临床药学、临床药理学的发展和 需要而建立起来的一门新兴学科。
• 生物样品药物分析，旨在通过各种分析手段，了 解药物在生物样品内的数量和质量变化。
• 获得药物代谢动力学的各种参数、药物在生物样
品内的生物转化、代谢的方式和途径等信息。
• 从而为药品生产、临床医疗、实验研究等方面对
研究中的药物作出估计与评价，对药物的改进与
存。
• 冷藏或冷冻时限经稳定性考察后确定。
• 血样的贮存： – 采集后及时分离血浆和血清（≤2h），分离后 再贮存
– 若不予先分离，血凝后冰冻保存，则因冰冻有
时易引起细胞溶解，会阻碍血浆或血清的分离。
• 注意事项： – 冷冻的样品测定时，需临时解冻。 – 解冻后的样品应一次性测定完毕，不应反复冻
④防止分析仪器的污染
• 生物样品基质中脂肪、蛋白质、不溶性颗粒会污
染分析仪器。 • 因此，应根据分析仪器的耐受程度，选择恰当的 预处理方法。
举
例
• 应用高效液相色谱法检测血药浓度，进行
样品预处理的作用。
1. 去除血浆（或血清）中的蛋白质 2. 延长色谱柱的寿命（去除固体杂质） 3. 改善选择性（排除生物基质的干扰） 4. 改善组分可测性（被测组分的富集） 5. 改善组分色谱行为（化学衍生化）
物的干扰
• 纯化与浓集——提高被测药物的灵敏度 • 样品经分离、纯化与浓集与测定方法相结合，达 到专属性强、灵敏度高、准确性好。
• 样品的预处理是体内药物分析中极为重要的环节。
• 也是分析中最困难、最繁杂的工作。
• 对于生物样品的预处理很难规定固定的程序和方式，
必须结合测定实际和要求，采取恰当的方法和技术。
• 1. 血样的采集：
• 一般用注射器直接采集静脉ห้องสมุดไป่ตู้，每次1~5ml；
• 动物实验时，采血量不宜超过动物总血量的十分
之一。
• 2. 血样的制备
• 测定血中药物的浓度，通常是指测定血浆或血清 中的药物浓度，尤其是血浆，并非指全血。
• 血浆的制备
• 采集的静脉血液置含有抗凝剂的试管中，混合后，
容和依据。
2.在临床合理用药中的意义
• 影响血药浓度的因素很多，同一种给药方案难以
对每一个病人都达到理想的治疗效果。
• 为达到用药安全、合理、有效，必须设计个体化
给药方案，就需要做好对治疗药物监测，以血药
浓度为指标，达到个体化用药。
课堂活动
•
•
《地高辛血药浓度监测２３３例结果分析》
请阅读该文献后，回答下列问题（以小组为单位，
发展作出贡献。
（二）生物样品中药物分析的意义
1.新药评价和新药开发中的意义 • 大量事实证明，如无临床药理学和临床药学研究给 新药以确切的评价，要做到临床安全、合理、有效 地用药将会遇到许多困难。 • 因此，加强药物在生物样品内作用机理的研究，以
了解和阐明药物结构、理化性质、剂型及生产工艺
与药物疗效等关系，已成为评价药品质量的重要内
因此要求分析方法要有较高的灵敏度。
• 一、生物样品中药物分析的性质和意义
• 二、生物样品中药物分析的对象和特点 • 三、生物样品的种类 • 四、生物样品分离、纯化与浓集
生 物 样 品
脏器组织 体液 血液、尿液、唾液、毛发、乳汁、 精液、脑脊液、泪液、胆汁、 胃液、胰液、淋巴液、粪便等
• 血液(血浆、血清)：体现药物浓度和治疗作用之 间的关系——最常用的生物样品。
以2500~3000r/min离心5~10min使与血细胞分离，
所得淡黄色上清液即为血浆（ plasma ） 。 • 抗凝剂—最常用的是肝素（heparin）。
• 其它抗凝剂EDTA、枸橼酸盐、草酸盐等。
• 3.血样的应用：
• 药物动力学 • 生物利用度 • 临床治疗药物浓度监测
• 尿液—用于药物剂量回收、尿清除率、生物
2.加入中性盐—“盐析”沉淀蛋白质 3.加入强酸—与蛋白质阳离子(铵基) 形成不溶性 盐沉淀
去除蛋白质的方法
• 4. 加入重金属盐—与蛋白质阴离子
• • (羧基)形成不溶性盐沉淀 • 5. 超滤法—半透膜滤除可溶性生物大 分子物质(蛋白质) • 6. 酶水解法—蛋白分解酶分解蛋白质 • 7. 加热法—蛋白质变性凝固
融。
– 如果采集的样品不能一次性测定，则应以小体
积分装贮存，每次按计划取一定数量进行测定。
• 一、生物样品中药物分析的性质和意义
• 二、生物样品中药物分析的对象和特点 • 三、生物样品的种类 • 四、生物样品分离、纯化与浓集
• 生物样品的预处理技术：
– 分离、纯化、富集或化学衍生化等，目的是为
药物的最终测定创造良好的条件。 • 分离——消除内源性物质、代谢物或其它共存药
– 含有尿素、肌酸、尿囊素、氨、Na+、K+、Cl-等。
• 药物组分： – 药物含量低，一般为“微克”或“纳克”水平，经预
处理使药物纯化、富集，以利于进一步检测。
③提高检测灵敏度
• 预处理—降低背景噪音—提高灵敏度
• 特异性强、灵敏度高的分析方法 – 预处理相对简单 • 不具备分离功能的方法(光谱法) – 预处理十分重要
– 游离型药物 – 代谢物 – 药物或代谢物与蛋白结合物 • 预处理：药物或代谢物从“结合物”或缀合物中 释放，测定药物或代谢物的总浓度。
②样品纯化
• 生物样品的基质——组成复杂、干扰多
• 例如：
• 血清： – 含有高分子的蛋白质和低分子的糖、脂肪、尿素等有 机物，也含有Na+、K+、Cl-等无机物。 • 尿液：
固相萃取法
• 优点： – 引入杂质少 – 完全避免乳化的形成
– 在优化条件下有较高的萃取率，重现性也较好
– 可以用较少量的样品 – 柱子为可弃柱，污染较小 • 缺点： – 价格昂贵
– 技术要求较高
课堂活动
• 阅读文献：《不同血浆样品制备方法对芍药苷血
液药物浓度测定的影响》 • 以小组为单位讨论并绘制“血浆样品处理方法” 的流程图。 • 以小组为单位上交作业。
利用度、内源性活性物质、药物代谢分型及代谢 物等的研究测定。
• 毛发—用于药物滥用监测及微量元素测定。
• 肝、胃、肾、肺、脑等脏器组织—动物试验研究药
物吸收、分布状态及服药过量中毒死亡。
生物样品的贮存与处理
• 冷藏—冰箱(4℃)中短期保存(1-2d) • 冷冻—冷柜(-20℃)或低温冷柜(-80℃)，中长期保
• 血液（blood）
• 血液中药物浓度可以较好地体现药物浓度和治疗 作用之间的关系。 • 是最为常用的生物样品。 • 分为全血、血浆和血清。
全血、血浆和血清的区别
• 全血：血液经抗凝处理后的全部血液。 • 血浆：离心除去血细胞后所得到的淡黄色液体。
• 血清：如血液不经抗凝处理，让其自行凝固，则
生物样品中药物分析
• 一、生物样品中药物分析的性质和意义
• 二、生物样品中药物分析的对象和特点 • 三、生物样品的种类 • 四、生物样品分离、纯化与浓集
一、生物样品中药物分析的性质和意义
（一）生物样品中药物分析的性质 （二）生物样品中药物分析的意义
（一）生物样品中药物分析的性质
• 生物样品药物分析，又称体液药物分析、生物药
（一）生物样品中药物分析的对象
• 凡是生物样品内药物到达之处，如体液、器官、 组织、排泄物等都是分析的对象。 • 所以生物样品内药物分析的样本有血液、尿液、 唾液、胆汁、淋巴液、泪液、脊髓液、汗液、乳 汁、各种器官以及呼出的气体等。
• 生物样品内药物分析的目标，不仅是母体药物也
包括代谢产物。 • 因为代谢产物常具有生理活性，弄清它们的种类、 结构、数量及分布情况，可了解药物在生物体内 的变化及消除规律，这对安全用药和正确评价药 物质量也是非常重要的。
液—液萃取法
• 原理： • 大多数药物为脂溶性，在有机溶剂中溶解度大于
水中溶解度。
• 大多数内源性杂质是强极性的水溶性物质。
• 溶剂选择—合适的溶剂是成功的主要条件
• 了解药物与溶剂的化学结构及其性质—相似相溶
的原则
• 沸点低、易挥散，毒性小与水不相混溶
• 不影响进一步检测
• 具有较高的化学稳定性和惰性
• 由于新药进入临床试验之前，或者对已上市药在
某一方面的重新评价，一般要求先在动物体上进 行实验，所以生物样品内药物分析对象不仅是人 体，也包括动物体。
（二）生物样品中药物分析的特点
• 与常规药物分析相比，生物样品内药物分析在灵敏 度和选择性等方面有较高的要求。
• 微量药物存在于大量生物介质中，样品中含内源性
在抽血后的一段时间内，血液会自动在一系列凝
血因子的作用下发生凝集，血液首先凝固成一个
整体，再经过一段时间或用离心机离心，血液中 凝固的部分会与一些清澈淡黄色的液体分离开， 这些液体称为血清。
血浆和血清的区别
• 血清与血浆从表面上看似乎没有什么不同，但其
内在的主要区别是血清中不含纤维蛋白原，是未 经抗凝处理过的血液凝固后得到的。
生物样品的预处理方法
1. 有机破坏法
2. 去除蛋白质法
3. 溶剂萃取法
4. 缀合物的水解法
5. 化学衍生化法
去除蛋白质法
• 可使结合型药物释放
• 去除蛋白后取上清液直接分析测定 • 去除蛋白后取上清液经进一步分离、纯化、浓集 后分析测定。
去除蛋白质的方法
•
• •
1.加入与水混溶的有机溶剂—蛋白质脱水沉淀
干扰杂质，这些干扰物质又随疾病情况不同而有所
不同。
• 很多药物在生物样品内经过代谢可产生一种或多
种代谢物，母体药物和代谢物又能同生物大分子 结合。 • 这一切给药物分离、分析带来困难，这就要求分 析方法具有更高的选择性。
• 另外，在生物样品中，药物浓度都很低，一般血 药浓度在10-6-10-9g/ml之间。 • 且生物样品若为血液，采集量又受到一定限制，