第七章生物大分子的色谱分离和纯化1讲义20319
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3. 样品既溶于水，又溶于有机溶剂，可选用分配色谱。
• 除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子 中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。
为何选择色谱作为生物分子纯化方法？
✓不产生热 ✓不产生外力 ✓高回收率 ✓高分辨率 ✓线性放大，可预期 ✓可自动化 ✓大量成功例子
Principles of Operation for Chromatography Techniques
2. 色谱具有高效、快速和灵敏的特点
色谱分离图示
根据混合物中，溶质在 互不相溶的两相之间分 配行为的差别，引起溶 质移动速度的不同而进 行分离的方法。
互不相溶的两相分别称 为：固定相和流动相。
色谱分离图示
三 、层析的分类
• ⑴根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类
离子交换色层分离法
吸附层析法 分配层析法
聚焦色谱 等电点和离子交换 分辨力高 作用
进 口 试 制 昂 蛋白质和酶 贵
三、色谱的分类
两相物理状态
流动 固定相 名 称 相
液相
液相色谱
液相 液液色谱
固相 液固色谱
作用机理
原理
名称
分配系数 吸附能力 分子大小 离子交换 能力 亲和力
液液分配色谱 液固吸附色谱 凝胶渗透色谱 离子交换色谱
亲和力色谱
固定相的物理特性
物理特性
名称
板状 纸
一薄层 根柱子 填充紧密 空心管壁 流动相高 压
平板色谱 纸色谱
薄层色谱 柱色谱(液相) 填充柱色谱 空心柱色谱 高效液相色谱
气体
液体 固体
气相色谱
根柱子 柱色谱(气相)
气液色谱 分配系数 气液分配色谱 填充紧密 填充柱色谱
气固色谱 吸附能力 气体吸附色谱 空心管壁 空心柱色谱
第七章生物大分子的 色谱分离和纯化 120319
复习
膜的污染
膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流 速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这 被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物 (附生)污垢所引起的。
复习
防止膜污染的方法
（1）预处理法 调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学 劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生 物性劣质等。 （2）开发抗污染的膜 （3）加大供给液的流速
吸附色谱与其它色谱法的异同点
类型
机理
优点
缺点
适用范围
吸附色谱 化学、物理吸附 操作简便
易受离子干 各种生物大分
扰
子的分离、脱
色、和去热源
凝胶过滤 分子筛的排阻效应 分 辨 力 高 ， 不 各 种 凝 胶 介 分 子 量 有 明 显 会引起变性 质 昂 贵 ， 处 差 别 的 可 溶 性 理量有限制 生物大分子
第七章
生物大分子的色谱分离与纯化
第一节 色谱概论
一、色谱的概念
色谱（层析）是一个建立在吸附、分配、离子交换、 亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色 层分离。
二、色谱的特点
1. 能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分 离并检测出来。
2. 它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中（其中静止 的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配 系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经 过就连是续色多谱次法在所两 依相据中的的基质本量原交理换。充，分从条而件使不同组分得以必分要离条，件这
据实验技术
据固定相的形状不 同 据流动相的物态不 同 按操作方式不同
类型
吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱
低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
迎头法
顶替法
洗脱法
特征
吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同
常用于大量制备分离
高压4.0 ~ 40MPa 主要用于成分分析
⑶ 根据固定相的形状不同的分类：
柱层析法 纸层析法 薄层层析法
⑷ 根据流动相的物态不同的分类
汽相层析法
液相层析法
⑸ 操作方式不同的Leabharlann Baidu类
迎头法 顶替法 洗脱分析法
层析分类
分类原则 据溶质分子与固定 相相互作用的机理 不同
疏水作用色层分离法 金属螯合色层分离法 共价作用色层分离法
凝胶过滤法
⑵ 根据实验技术的分类
低压层析技术 ——操作压力小于0.5MPa
中压层析技术 ——操作压力在0.5MPa-5MPa之间
高压层析技术 ——操作压力在5Mpa-40MPa之间
电泳法
——靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离
低压 0.5MPa 中压0.5 ~ 4.0MPa
分配色谱 溶质在固定相和流 分 辨 力 高 ， 重 影 响 因 子 多 ，用 于 各 种 生 物
动相中分配系数的 复 性 较 好 ， 能 上样量太小 大 分 子 的 分 析
差异
分离微量物质
鉴定
亲和色谱 亲和色谱生物大分 分辨力很高 子与配体之间有特 殊亲和力
一种配体只 各种生物大分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大
1.5 层析剂种类
⑴氧化铝 ⑵硅胶 ⑶活性炭 ⑷琼脂糖 ⑸ 纤维素
• 现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物 制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲 和色谱等。选择的原则：
1. 易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；
2. 水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交 换色谱；
操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同
固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 固定相在玻璃平板上铺成薄层
流动相为气体 流动相为液态 流动相为液态
将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流 出，但其它各组分都不能达到分离。 利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱 溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。
• 除了平板、纸和薄层色谱外，其余色谱都可以在柱子 中进行，因此柱色谱的应用非常广泛。
为何选择色谱作为生物分子纯化方法？
✓不产生热 ✓不产生外力 ✓高回收率 ✓高分辨率 ✓线性放大，可预期 ✓可自动化 ✓大量成功例子
Principles of Operation for Chromatography Techniques
2. 色谱具有高效、快速和灵敏的特点
色谱分离图示
根据混合物中，溶质在 互不相溶的两相之间分 配行为的差别，引起溶 质移动速度的不同而进 行分离的方法。
互不相溶的两相分别称 为：固定相和流动相。
色谱分离图示
三 、层析的分类
• ⑴根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类
离子交换色层分离法
吸附层析法 分配层析法
聚焦色谱 等电点和离子交换 分辨力高 作用
进 口 试 制 昂 蛋白质和酶 贵
三、色谱的分类
两相物理状态
流动 固定相 名 称 相
液相
液相色谱
液相 液液色谱
固相 液固色谱
作用机理
原理
名称
分配系数 吸附能力 分子大小 离子交换 能力 亲和力
液液分配色谱 液固吸附色谱 凝胶渗透色谱 离子交换色谱
亲和力色谱
固定相的物理特性
物理特性
名称
板状 纸
一薄层 根柱子 填充紧密 空心管壁 流动相高 压
平板色谱 纸色谱
薄层色谱 柱色谱(液相) 填充柱色谱 空心柱色谱 高效液相色谱
气体
液体 固体
气相色谱
根柱子 柱色谱(气相)
气液色谱 分配系数 气液分配色谱 填充紧密 填充柱色谱
气固色谱 吸附能力 气体吸附色谱 空心管壁 空心柱色谱
第七章生物大分子的 色谱分离和纯化 120319
复习
膜的污染
膜分离过程中随着操作时间的增加，膜透过流 速的迅速下降，溶质的截留率也明显下降，这 被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物 (附生)污垢所引起的。
复习
防止膜污染的方法
（1）预处理法 调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学 劣化；预先清除供给液中的微生物，以防止生 物性劣质等。 （2）开发抗污染的膜 （3）加大供给液的流速
吸附色谱与其它色谱法的异同点
类型
机理
优点
缺点
适用范围
吸附色谱 化学、物理吸附 操作简便
易受离子干 各种生物大分
扰
子的分离、脱
色、和去热源
凝胶过滤 分子筛的排阻效应 分 辨 力 高 ， 不 各 种 凝 胶 介 分 子 量 有 明 显 会引起变性 质 昂 贵 ， 处 差 别 的 可 溶 性 理量有限制 生物大分子
第七章
生物大分子的色谱分离与纯化
第一节 色谱概论
一、色谱的概念
色谱（层析）是一个建立在吸附、分配、离子交换、 亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色 层分离。
二、色谱的特点
1. 能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分 离并检测出来。
2. 它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中（其中静止 的一相为固定相，相对运动的一相为流动相），吸附能力、分配 系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经 过就连是续色多谱次法在所两 依相据中的的基质本量原交理换。充，分从条而件使不同组分得以必分要离条，件这
据实验技术
据固定相的形状不 同 据流动相的物态不 同 按操作方式不同
类型
吸附色谱 离子交换色谱 疏水作用层 金属螯合色谱 共价作用色谱 分配色谱 凝胶过滤 亲和色谱
低压色谱 中压色谱 高压色谱 电泳
柱色谱 纸色谱 薄层色谱
气相色谱 液相色谱 超临界流体色谱
迎头法
顶替法
洗脱法
特征
吸附力不同 各物质与固定相之间的离子交换能力的不同 各物质与固定相之间的疏水作用的强弱不同 各物质与固定相上的金属离子的络合能力的不同 巯基化合物的巯基与固定相表面的二硫键作用力不同 各物质在两液相间的分配系数不同 各物质的分子大小或形状不同 利用生物大分子与各种配基的生物识别能力不同
常用于大量制备分离
高压4.0 ~ 40MPa 主要用于成分分析
⑶ 根据固定相的形状不同的分类：
柱层析法 纸层析法 薄层层析法
⑷ 根据流动相的物态不同的分类
汽相层析法
液相层析法
⑸ 操作方式不同的Leabharlann Baidu类
迎头法 顶替法 洗脱分析法
层析分类
分类原则 据溶质分子与固定 相相互作用的机理 不同
疏水作用色层分离法 金属螯合色层分离法 共价作用色层分离法
凝胶过滤法
⑵ 根据实验技术的分类
低压层析技术 ——操作压力小于0.5MPa
中压层析技术 ——操作压力在0.5MPa-5MPa之间
高压层析技术 ——操作压力在5Mpa-40MPa之间
电泳法
——靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离
低压 0.5MPa 中压0.5 ~ 4.0MPa
分配色谱 溶质在固定相和流 分 辨 力 高 ， 重 影 响 因 子 多 ，用 于 各 种 生 物
动相中分配系数的 复 性 较 好 ， 能 上样量太小 大 分 子 的 分 析
差异
分离微量物质
鉴定
亲和色谱 亲和色谱生物大分 分辨力很高 子与配体之间有特 殊亲和力
一种配体只 各种生物大分 能用于一种 子 生物大分子， 局限性大
1.5 层析剂种类
⑴氧化铝 ⑵硅胶 ⑶活性炭 ⑷琼脂糖 ⑸ 纤维素
• 现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外，生物 制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲 和色谱等。选择的原则：
1. 易溶于有机溶剂而难溶于水的样品，选择吸附色谱；
2. 水溶液中可解离成离子的水溶性样品，可选用离子交 换色谱；
操作压力小于0.5 MPa 操作压力在0.5～5 MPa之间 操作压力在5～40 MPa之间 溶质分子在电场中的移动速度不同
固定相装在玻璃、不锈钢或有机玻璃柱中 固定相为以氢键与纤维素羟基结合的水 固定相在玻璃平板上铺成薄层
流动相为气体 流动相为液态 流动相为液态
将混合物溶液连续通过固定相，只有化学亲和力最弱的组分以纯粹状态最先流 出，但其它各组分都不能达到分离。 利用一种化学亲和力比各被结合组分都强的物质来洗脱，这种物质称为顶替剂。 此法处理量大，且各组分分层清楚，但层与层相连，故不能将组分分离完全。 将混合液尽量浓缩，使体积缩小，引入固定相的一端，然后用溶剂洗脱，洗脱 溶剂可以是原来溶解混合物的溶剂，也可选用另外的溶剂。