细胞适配体筛选的实验设计疑问解答

细胞适配体筛选实验设计及解疑问：

Development of DNA aptamers using Cell-SELEX

1、引物及文库设计：PCR是适配体筛选过程的重要环节，因此设计扩增效率高

的引物及文库尤其重要。上游引物5端标记FITC，主要作用是为了用流式检测筛选进程。下游引物5端标记生物素，生物素的存在下有助于通过链霉抗生物素相互作用进行PCR，接着碱变性来分离有义和反义链。

2、细胞系（正和负）：细胞系的选择取决于所述选择的目的。细胞SELEX已普遍

使用培养的癌细胞系来进行，已经筛选出的适配体可在两个不同的癌症之间或癌细胞和正常细胞之间的区别。

3、细胞培养。细胞SELEX使用活细胞作为靶，因此良好的细胞培养是非常重要

的。过生长的细胞培养会导致更多的细胞死亡，并且能很可能导致在细胞形态和蛋白质表达的改变。死细胞有害于筛选，特别是当使用悬浮培养细胞。

减少或消除死细胞可以显著提高选定pool的富集。贴壁单层细胞的存活力不是显著的问题，因为大部分的死细胞通常在培养基中浮动，并且一旦介质被除去，就会得到比较的健康细胞。尽管如此，细胞必须不能过度生长。有两种方法由贴壁单层细胞可用于选择：要么直接在培养皿或作为细胞解离的细胞。直接选择可以提供一个更好的代表性细胞的自然环境。解离的细胞或者通过非酶促解离缓冲液的短期胰蛋白酶处理对细胞来说是苛刻的，或许是改变了细胞膜表面的的一些表达。

4、洗脱结合的序列。序列结合靶细胞的回收是通过加热该细胞-DNA复合物至

95℃下实现的。有双重理由去解释加热的必要性，将细胞悬液加热到95℃以洗脱结合的序列：（ⅰ）温度升高将导致细胞表面蛋白变性，而这将导致DNA 和蛋白质之间的相互作用的破坏。（ii）DNA的折叠结构被破坏，引起DNA 的靶蛋白的释放。在95℃，细胞破碎后所释放的DNA酶在高温下被灭活，因此不能引起DNA消化。

5、PCR程序。PCR是这个协议的重要组成部分，它的成功可以提高甄选过程的成

功。在开始筛选过程，优化退火温度和所有PCR试剂的浓度，包括引物。第一轮选择后，需要进行三种不同的PCR扩增：（ⅰ）扩增整个筛选池，（ⅱ）用于确定最佳循环的PCR和（ⅲ）为下一轮筛选制备筛选库的PCR。然而，在随后的筛选，只有（ii）和（iii）的需要执行。

6、DNA单链的制备。对称PCR制备的双链DNA需要被分离，而FITC标记的序列

需要被回收继续筛选过程。在这个过程中，我们坚持并且成功通过碱变性和亲和纯化与链亲和素包被的Sepharose珠地从生物素化的反义的单链DNA分离出正义单链DNA（ssDNA）。而最近，有关使用链霉亲和包被的磁珠来制备ssDNA的问题越受关注。作者报道，使用链亲和素包被的磁珠和随后的碱性分离的单链DNA的制备通常是由两个链霉和生物素标记的序列沾染的ssDNA 制备相关的问题，这引起细胞聚集。他们因此不能用磁珠的分离方法去富集筛选池。然而，在我们的系统中，我们一直使用链亲和素包被的Sepharose

珠却没有任何困难。尽管我们没有进行凝胶染色，以评估和链霉抗生物素的存在，我们从未观察到任何细胞聚集这一假设的现象。因此，我们相信，我们的系统为单链DNA的准备是有效的。

7、阴性筛选。第二轮筛选出来的DNA库，可用于进行阴性筛选去剔除非特异性

结合的序列。从负筛选池中删除所有这些序列几乎是不可能的，剩余的序列可以进行PCR然后扩增。然而，如果阴性选择定期进行，大多数这些序列可以消除，并且他们将无法填充筛选池。所有在每一轮筛选的最后产生的筛选池（DNA池）被用于阴性筛选。

8、筛选过程监测。筛选池的富集，导致潜在的适配子候选物中选择的过程的演

变中，通过流式细胞术（悬浮和贴壁细胞），或显微镜（贴壁细胞）监测。为确保一致性，期望后两个或三个连续的选择，而不是每一轮之后进行结合测定以监测所选内容的进度。在同一时间，并在相同的条件下进行结合测定可以更容易地进行比较的结果;因此，两个连续的池之间的任何信号差可以评估良好。另外，该监视策略使得一个评估一般选择过程。