蛋白质相互作用研究方法

BD
UAS
AD
lacZ
两种待检测蛋白(X、Y)分别和AD、BD 融合表达, X与Y之间的相互 作用就可以将BD和AD在空间结构上重新联结为一个整体而与报告 基因的上游激活序列（upstream activation sequence）结合，进 而发挥激活转录的功能，使受调控的报告基因得到表达。
UAS
Protein-protein Interaction
蛋白质-蛋白质相互作用 研究方法
许多生命活wk.baidu.com是以蛋白质分子的结合和解离来实现 的，细胞的各种重要生理活动，细胞对外界环境及 内环境作用的反应等，均是以蛋白质间相互作用为 纽带，形成信号转导网络系统。
生物学效应
稳定相互作用 形成蛋白质复合体
瞬时相互作用
优势：能简单方便地通过观察荧光鉴定蛋白质相互 作用，不依赖外源的荧光素或显色剂等，能检测到
瞬时或者较弱的相互作用，并且可提供亚细胞定位
信息。 缺陷：融合蛋白的相互结合和荧光发生有一定时间 延迟，一些融合蛋白的结合是不可逆的，不能实时 反应蛋白质的结合和分离情况。
蛋白质-蛋白质相互作用研究方法
•酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) •串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP)
BD
lacZ
优点：简便、易用、费用低廉，能检测到瞬时或较弱的
蛋白质相互作用； 缺点：较高的假阳性，不能真实反映蛋白质在自身细胞 中的相互作用，表达的融合蛋白最终要运送到酵母细胞 核，而有些蛋白可能具有其他亚细胞定位信号肽等。
蛋白质-蛋白质相互作用研究方法
•酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) •串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP)
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
免疫共沉淀
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
双分子荧光互补技术
原理是将荧光蛋白分成两个无独立功能的片段，分别 与需要检测的蛋白X和蛋白Y融合表达，如果bait融合 蛋白和prey融合蛋白存在相互结合作用，而这种结合 促使荧光蛋白的两个片段相互作用发出荧光。
且易出现假阴性。
谢 谢
蛋白质-蛋白质相互作用研究方法
•酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) •串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP)
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
CFP-YFP等。
优点：
能比较可靠地反映蛋白质相互作用时的距离；能检测到瞬 时、较弱的蛋白质相互作用；能同时检测到两蛋白的细胞 分布和作用位点。
缺点：
是供体蛋白的激发光谱和受体蛋白的光谱可能存在重叠,
影响实验结果； 供体蛋白和受体蛋白的空间结构较大, 限 制了两者之间的距离，导致FRET 发生效率低( 约40%)，
基本原理：分别将bait 蛋白、prey 蛋白与相应的供体荧光基团 ( 如ECFP) 和受体荧光基团( 如EYFP) 融合, 当 bait蛋白和
prey 蛋白相互结合作用时,
很近( 约10 nm),
供体基团和受体基团两者之间的距离
供体基团的发射光激发受体基团发射荧光。常
用的供体荧光蛋白和受体荧光蛋白对有 BFP-GFP、BFP-EGFP 、
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
串联亲和纯化(TAP)
基因构建：在目标蛋白的一端依次导入钙调蛋白结合肽、 TEV蛋白酶切位点和蛋白标签(如蛋白A、寡聚组氨酸肽段 等)，进而在宿主细胞中进行融合表达，在生理条件下形 成与目标蛋白相互作用的蛋白复合物。
串联亲和纯化
分离纯化： 第一步 利用与蛋白标签具有亲和作用的色谱柱结合标签； 第二步 洗脱后采用TEV蛋白酶断裂TEV蛋白酶切位点； 第三步 利用与钙调蛋白结合肽具有亲和作用的钙调蛋白色谱柱结合 钙调蛋白标签； 第四步 洗脱蛋白，进一步进行鉴定。
两种蛋白在细胞内发生相互 作用时会形成两种蛋白的复 合物，这样就可以先用一种 蛋白的抗体把免疫复合物沉 淀下来，然后用另一种蛋白 的抗体进行Western blotting 检测。
免疫共沉淀
优点：可以保留蛋白质的修饰和结合状态，同时所需
的样本量较少,实验成本较低，减少了纯化步骤，能检
测到瞬时和较弱的蛋白相互作用； 缺点：Co-IP特异性较低，洗脱混合物中往往含有较多 的非特异结合蛋白。 因此，Co-IP 检测到的潜在相互作用蛋白需要通 过BiFC、FRET 等其他方法进一步验证。
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
荧光共振能量转移(FRET)
（enzyme-substrate） （protein complex）
稳定的相互作用与瞬间的相互作用共同构成蛋 白质相互作用的内涵。
蛋白质相互作用 关系的复杂性， 超出任何个人或 特定机构的研究 能力。 如何研究蛋白质 相互作用？
酵母蛋白质相互作用联络图 人蛋白质相互作用联络图
如此复杂的相互作用，哪些是有相关功能的？哪些 是“噪音”？
串联亲和纯化
优点：能减少非特异性蛋白结合，能保留蛋白复合物 在细胞内的修饰和结合状态。
缺点：需要较多的样本材料来提取蛋白，价格比较昂
贵, 不能高效检测到瞬时或较弱的蛋白质相互作用。
蛋白质-蛋白质相互作用研究方法
•酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) •串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP)
complementation, BiFC)
•荧光共振能量转移(Fluorescence resonance energy
transfer, FRET)
酵母双杂交系统(Y2H)
很多真核生物的转录因子如酵母Gal4 由两个具有不同功能的结构域 组成：转录激活结构域(Transcriptional activation domain, AD) 和DNA结合结构域(DNA binding domain, BD) 。 BD可识别DNA上的特异序列，并使转录激活结构域定位于所调节的基 因的上游，AD可和转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基 因的转录。
蛋白质-蛋白质相互作用研究方法
•酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system, Y2H) •串联亲和纯化(Tandem affinity purification, TAP)
•免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation, Co-IP)
•双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence