第十二章 液质联用

第十二章液相色谱-质谱联用技术(LC-MS)

12.1 概述

LC-MS联用的研究起步于20世纪70年代。多数质谱仪具有对样品纯度要求较高、可进行有效定性分析的特点；色谱是分离复杂混合物中不同组分最常用的方法之一，但是在定性、定量结构分析方面相对质谱仪较差。因此，将色谱技术和质谱技术联用既可以充分发挥色谱法高分离效率的优点又可以充分发挥质谱法高定性专属性的能力的优点，这为科研工作者提供了一种可以对复杂化合物进行高效定性定量分析的工具。在色谱-质谱联用仪中，气相色谱-质谱(GC-MS)联用仪是最早开发的色谱联用仪器，但在自然界和人工合成的化合物中，不挥发或热不稳定的化合物约占80%，只能用液相色谱分离。液相色谱-质谱联用(LC-MS)比气相色谱-质谱联用困难得多，主要是因为液相色谱的流动相是液体，如果让液相色谱的流动相直接进入质谱，则将严重破坏质谱系统的真空，也将干扰被测样品的质谱分析。因此，液相色谱-质谱联用技术发展的比较缓慢。

进入20世纪90年代，液相色谱-质谱联用（LC-MS）技术的发展最为引人注目。这是因为LC-MS中的MS应是“软的”多级串联质谱（MS n）。一般情况下，LC-MS检测的是非挥发或热不稳定的样品，因此需要找到一种能将低浓度样品分子传到气相中的方法。另外，热不稳定性化合物的检测应该采取“软电离”的方式以避免因失去分子离子峰而得不到化合物的分子量信息。20世纪末发现的电喷雾接口（ESI）和大气压下电离接口（APCI），不仅解决了使用LC-MS时对液相色谱流动相的诸多限制，而且大大提高了检测的灵敏度。此外，还可以根据“软电离”方式产生的准分子离子峰并结合多级质谱产生的丰富结构碎片，准确地推断未知化合物的结构。利用MS-MS进行选择反应检测（SRM），具有很高的选择性，因而具有很高的定量灵敏度和可靠性。通过大气压下的接口，液相色谱不仅可以与四级杆质谱联用，而且还可以与当今最先进的正交飞行时间质谱、基质辅助飞行时间质谱以及离子阱质谱联用。基质辅助飞行时间质谱不仅可以对液相色谱的流出物进行高灵敏度检测，而且可以精确地给出相对分子质量，继而确定化合物的分子式。而液相色谱-离子阱质谱联用技术则可以根据给出的多级质谱来确定相对分子量和结构信息。因此，液相色谱和质谱的成功联用不仅可以解决色谱难于解决的化合物的定性问题，而且也将为质谱的分析提供极大的方便性和灵活性，为质谱提供更加广阔的应用前景，为复杂样品的分析提供更为强有力的手段。

当今，LC-MS已广泛应用于各个领域。在生物工程方面，它的出现为生物化学家能在分子水平上研究碱基对的测序、核酸、多肽以及蛋白质结构信息提供了有效的平台，大大提高了质谱的检测范围，有利于对活性官能团的分析与检测；在有机化学合成方面，可以用LC-MS监控反应进程，鉴定中间体产物并筛选最佳反应条件；在医学方面，LC-MS可以检测运动员体内兴奋剂、可卡因等违禁成分；在食品安全方面，可以用LC-MS检测食品中微量的添加剂以及致癌物质等；在环保方面；可以用LC-MS检测水源、空气和土壤等中的污染物种类以及污染程度。

不仅如此，随着色谱-质谱联用技术的不断改进，LC-MS已成为现代仪器分析中不可或缺的重要组成部分。特别是与串联质谱(MS-MS)的联用技术得到了极大地发展和推广。具有高效分离能力的液相色谱与高选择性、高灵敏度的MS-MS结合使用实现了对未知化合物的实时分析。即使化合物极性相近难以分离，同样可以通过串联质谱对目标化合物中性碎片扫描提高混合物中目标化合物的信噪比。

12.2 液相色谱-质谱仪器系统

12.2.1液相色谱-质谱联用仪组成

液相色谱或质谱仪器类型很多，用途不同，但多数仪器的组成结构基本相同。它们是液相色谱系统、质谱系统及数据处理系统等。以LC-MS (四极杆)联用仪器为例其主要的构成如图12-1所示。只要采用适当的连接方式，将色谱柱出口和质谱进样口连接起来，即可成为液相色谱和质谱联用的系统。去掉连接件，将色谱柱接回到色谱检测器，仍是可独立使用的液相色谱和质谱仪。

1-液相入口；2-雾化喷口；3-离子源；4-高压放电针；5-毛细管；6-CID区；7-锥形分析器；8-八极杆；9-

四极杆；10-HED检测器

图12-1 液相色谱-质谱的基本结构

在专用型液相色谱-质谱联用商品仪器尚未普及时，一些实验室使用的联用系统都是这样构成的。如今已经有许多配置不同、性能各异的专用型液相色谱-质谱联用仪器，供不同用途选择。不同厂家各种型号的LC-MS联用仪器多达几十种，有小型台式的液相色谱-单四极（single quadrupole）质谱或三重四极（triple quadrupole）质谱联用仪，液相色谱-离子阱（ion traps）质谱联用仪，液相色谱-飞行时间（time of flight，TOF）质谱联用仪（LC/TOF）以及液相色谱-扇形磁场（magnetic sector）质谱联用仪等。

12.2.1.1 高效液相系统

高效液相色谱仪一般包括四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。此外，还可以根据一些特殊的要求，配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样及数据处理装置等，见图12-2。

图12-2 HPLC流程图

高效液相色谱系统是构成液质联用仪的重要组成部分，这部分可以参考有关液相色谱部分的具体内容。由于要与质谱联用，其在流动相组成、色谱条件等方面与常规的液相色谱之间存在着一定的不同。在液质联用过程中，为了加快样品的分析过程，在液相上通常采用了梯度程序洗脱过程，通常的液质联用中配置了二元泵或四元泵系统。

色谱柱是实现样品分离的重要部件，在液质联用中根据使用方法、离子源的种类等的不同所选择的色谱柱也有一定的区别。对于分析型的液相色谱而言如果质谱选择了ESI离子源，建议使用内径小于4.6 mm的微径柱，如果质谱选择了大气压化学电离源（APCI），建议使用内径为4.6 mm的色谱柱。

12.2.1.2 质谱系统

液质联用仪是实现样品液相分离并检测过程的仪器，无论液质联用仪的类型如何变化，构成质谱系统的5个基本组成部分皆是相同的，它们是接口、电离源、真空系统、检测系统及数据处理系统。

电离源是将引入的样品转化为正或负离子，并使之加速，聚焦为离子束的装置。电离样品分子所需要的能量随分子类型的不同而变化，因此，应根据分子的类型选择与之适配的电离源。

根据样品离子化方式和电离源能量高低，通常可将电离源分为：

（1）硬源：离子化能量高，伴有化学键的断裂，谱图复杂，可得到分子官能团的信息，如电子轰击，快原子轰击。

（2）软源：离子化能量低，产生的碎片少，谱图简单，可得到分子量信息，如化学电离源(CI)，电喷雾电离源(ESI)，大气压化学(APCI)电离源。

质谱仪中所有部分均要处于高度真空的条件下(10-4 Pa ~10-6 Pa)，其作用是减少离子碰撞损失。真空度过低，将会引起：大量氧会烧坏离子源灯丝；引起其它分子离子反应，使质谱图复杂化；干扰离子源正常调节；用作加速离子的几千伏高压会引起放电。

液相色谱-质谱联用质量分析器的作用就是将不同离子碎片按质荷比m/z分开，将相同m/z的离子聚集在一起，组成质谱。质量分析器类型：磁分析器、飞行时间、四极杆、离子捕获等。

12.2.2 液相色谱-质谱联用技术特点

质谱分析是先将物质离子化，变为气态离子混合物，并按离子质荷比的不同而分离，然后测量各种离子谱峰的强度而实现分析目的的一种分析方法。它不仅弥补了GC-MS的不足之处，而且还有以下优点：

（1）高普适性：质谱仪的出现，有效的解决了热不稳定性化合物分析检测的难题；

（2）高分离能力：有些时候由于化合物极性非常接近，很容易出现在色谱柱上不能完全分离的状况。质谱分析不仅可以有效的检测出所有化合物的分子量，而且还可以通过二级质谱图给出不同化合物各自的结构信息；

（3）高灵敏度：质谱仪具有很高的灵敏度，一般在<10-12 g水平下的样品都可以通过质谱法进行检测。与此同时，对于没有紫外吸收的复杂化合物，质谱分析法表现的更是得心应手；

（4）给生物化学家提供了一个从分子水平上进行研究的平台；

（5）高效的制备系统，有效地解决了传统UV制备中的难题，从很大程度上提高了制备系统的性能。

12.2.3 液相色谱-质谱联用技术的接口

液相色谱-质谱联用的关键技术是液相色谱仪与质谱仪的接口装置。该装置在去除溶剂以及促进样品分子离子化过程中发挥着巨大作用。液相色谱-质谱联用技术的研究开始于20世纪70年代，与气相色谱-质谱联用联用技术相比，液相色谱-质谱联用技术经历了一个更加漫长的探索过程。早期的接口装置，如传送带接口、热喷雾接口、粒子束接口等，都因存在不同程度的缺陷而使液相色谱-质谱联用技术没有得到商业化的应用。直到90年代，大气压化学电离源（APCI）的出现才给液相色谱-质谱联用技术带来一次历史性的变革，也正是由于它的出现才进一步的推动了液相色谱-质谱联用技术商业化应用的步伐。

12.2.3.1 直接液体导入接口

最初的直接液体导入接口（DLI）出现于20世纪70年代，但这一技术始终停留在实验室使用阶段，没有真正形成商品化仪器。