培养细胞的生长增殖过程

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2．传代期
初代培养细胞一经传代后便改称做细胞系（Cell Line）。在 全生命期中此期的持续时间最长。在培养条件较好情况下，细 胞增殖旺盛，并能维持二倍体核型，呈二倍体核型的细胞称二 倍体细胞系（Diploid Cell Line）。为保持二倍体细胞性质，细 胞应在初代培养期或传代后早期冻存。当前世界上常用细胞均 在不出十代内冻存。如不冻存，则需反复传代以维持细胞的适 宜密度，以利于生存。但这样就有可能导致细胞失掉二倍体性 质或发生转化。一般情况下当传代10～50次左右，细胞增殖逐 渐缓慢，以至完全停止，细胞进入第三期。
（3）增加了培养瓶的培养面积。
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B 培养板培养法
培养板培养法曾被称为微量培养法，是 现代体外培养技术最为常用的方法之一。 具体做法是将培养细胞接种在培养板的 孔内，然后在C02培养箱内培养。最常用 的培养板有6孔、24孔和96孔培养板，后 者最为常用。一般都是一次性使用。
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一体外培养细胞的生长增殖过程
原代培养期:从体内取出组织接种培养到第 一次传代培养这个阶段，一般持续1-4周。 这个阶段细胞比较活跃，有细胞分裂，但 不旺盛。 传代期：从原代培养的细胞的一经传代后 便称细胞系。细胞增殖旺盛，当传代10-50 次后，细胞增殖缓慢，以致完全停止。 衰退期：细胞增殖缓慢或不增殖。细胞轮 廓增强，最后衰退凋亡。
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16 14
12 10 8 6
初代培养
细胞系
（连续细胞系）
传代期
老化
02
4
6
8
10
12 14 周
3．衰退期：
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此期细胞仍然生存，但增殖很慢或不增殖；细胞形态轮廓增强， 最后衰退凋亡。在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任 何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细 胞可能发生自发转化（Spontaneous Transformation）。转化的标志 之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性 （Malignancy）。细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖 能力，这样的细胞群体称无限细胞系（Infinite Cell Line），也称 连续细胞系（Continuous Cell Line）。无限细胞系的形成主要发生 在第二期末，或第三期初阶段。细胞获不死性后，核型大多变成 异倍体（Heteroploid）。细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后 的细胞也可能具有恶性性质。细胞永生性和恶性性非同一性状。
组织块培养 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
组织块的原代培养方法，首先从机体某 部位取下组织，方法：
处死动物
将组织块剪碎
Hanks液
冲下剪刀上的碎块，补加
3~5mLHanks液
吹打、低速离心、
弃上清液、留下组织块
吸管取
出组织块放入培养瓶内，使其贴在瓶壁
上，（有组织块的瓶壁朝上）加入培养
液
培养
传代
2、培养过程：
处死动物 ---- 将组织块剪碎
Hanks液
冲下
剪刀上的碎块，补加3~5mLHanks液
吹打、低
速离心、弃上清液、留下组织块 :组织消化-----吸管
取出组织液放入培养瓶内，加入培养液 ------ 培养--
- 传代
接种 加入培养基 培养（每次换液后更换新的瓶塞 ）
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二培养法
培养瓶培养法
培养板培养法
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A 培养瓶培养法
所谓培养瓶培养法，就是将培养对象直接接 种于培养瓶内，再放人培养箱进行培养。
早期的培养瓶是玻璃培养瓶，目前主要用 一次性的塑料培养瓶。与一般瓶子不同，采用 的材料都是透明、对生物细胞无毒的材料。采 用的玻璃大多是硼硅酸玻璃。形状主要采用适 合细胞贴壁生长和显微镜观察的扁平形状。
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1.原代培养（Primary Culture）期：
也称初代培养，即从体内取出组织接种培养到第一次传代阶段，一 般持续1一4周。此期细胞呈活跃的移动，可见细胞分裂，但不旺盛。初 代培养细胞与体内原组织在形态结构和功能活动上相似性大。细胞群是 异质的（Heterogeneous），也即各细胞的遗传性状互不相同，细胞相互 依存性强。如把这种细胞群稀释分散成单细胞，在软琼脂培养基中进行 培养时，细胞克隆形成率（Cloning Efficiency）很低，即细胞独立生存 性差。克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细 胞小群（克隆）的百分数。初代培养细胞多呈二倍体核型；由于原代培 养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象。
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三 原代培养技术
幼体比老龄更容易培养，尤其是胚胎组织；分化低 比分化高的容易培养；肿瘤比正常组织容易培养。 任何动物细胞培养均从原代培养开始。 原代培养分为两种：组织块培养法和组织消化培养
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原代培养
包括：取材、分散细胞、接种、培养 等． 在所有操作中，多都要注意保持培养物 及生长环境的无菌条件。
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组织块也可用两只手术刀片将组织块切 碎，这样对细胞损伤较小，但操作时间 长，容易污染。 对某些软组织如肿瘤、胚眙、脑等可将 碎组织块放人注射器玻璃管中挤压分离。
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组织消化培养
1、取材分离和组织消化：用生物化学方法将剪碎的组 织分散成细胞团或单细胞ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ胰蛋白酶，适用于细胞间 质较少的软组织。
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与此相关的一种方法是盖玻片+培养瓶培养， 就是以盖玻片为生长表面，将拟培养的组织、 细胞接种于盖玻片上，然后放进培养瓶中进行 培养。这样具有以下几优点：。
(1)可以避免培养瓶表面粗糙等原因对培养 物的影响。
(2)可以方便地进行显微镜观察、染色等操 作，以及永久保存。
传代培养
根据细胞生长的特点，传代方法有3种： 1．悬浮生长细胞传代