实验九_卵磷脂的提取和鉴定
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实验九 卵磷脂的提取、纯化和鉴定
一、实验目的
1、学习和掌握卵磷脂的提取和鉴定方法； 2、掌握薄层层析的原理、方法和应用。
是细胞膜磷脂双分子层的重要成分。
卵磷脂又称磷脂酰胆碱，是甘油磷脂的一种。在动植物
体内均有分布，在动物的脑、精液、心、肝、肾上腺和 卵细胞中含量较多，蛋黄中含量可达8-10％。
1、调浆：称取硅胶-G 4.5g →烧杯→ 12ml 0. 2%羧 甲基纤维素钠溶液→用玻璃棒调匀搅拌为浆状液。 2、涂布：取洁净、干燥玻璃板一块→下衬一张白纸→ 在桌面上放平→用烧杯将浆状物均匀倒在玻璃板上， 从一端开始，保持均匀一致，涂布面积1 ～4/5 。 3、干燥：在室温下凉干2分钟→60℃干燥箱烘30分钟。 4、活化：将干燥箱升温至120 ℃ ，活化30分钟后，关 闭电源，当玻璃板面温度降至不烫手时取出。
E
D C B A O O1 O2
六、思考题：
1、简述卵磷脂的生物学功能。
2、磷脂酰胆碱（卵磷脂），磷脂酰乙醇
胺（脑磷脂），磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇 的结构式。 3、何谓薄层层析？其原理和方法？ 4、制备硅胶-G薄层板与点样时应注意些什么问题？ 5、本实验中，哪一种组分的Rf值大一些？ 为什么？
7、显色：用喷雾器向薄层板上均匀喷洒1%碘液溶
液，热风吹干至色斑显现。
五、实验结果
1、卵磷脂收率 卵磷脂收率 = 卵磷脂粗品重量 / 蛋黄重量×100% 2、计算各组分的Rf 值 3、判断卵磷脂粗提物的组分 四种磷脂标准品的Ｒf值分别为:溶血卵磷脂0.18；神 经鞘磷脂0.33；卵磷脂0.65；磷脂酰乙醇胺0.96
5、点样：样点距玻璃板一端下缘1cm ，相互间隔
1～1.2 cm ；每位点重复点五次，每次用冷风吹干 后再点，每次点样直径不超过2mm 。 6、展层：在层析缸中加入展层剂0.5cm深，加盖平 衡30分钟，将点样端浸入，密闭展层10-30min。后
取出薄层板，标出展层剂前沿位置，用电吹风热风
将薄层板吹干。
（3）展层剂 ：氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4) ；
（4）显色剂：1% 碘液。
四、实验步骤
（一）卵磷脂的提取
1、卵磷脂的粗提 蛋黄10g放入洁净的带塞三角瓶中，加入95%乙醇 40ml，搅拌15min后，静置15min；然后加入10ml的乙 醚，搅拌15 min后，静置15min；过滤；滤渣进行二次提 取，加入乙醇与乙醚(体积比为3：1)的混合液30ml，搅拌、 静置一定时间；第二次过滤，合并二次滤液，加热浓缩至少 量，加入一定量丙酮除杂，卵磷脂即沉淀出来，即得到卵磷 脂粗品。
其结构式为：
胆
碱
HO
二、实验原理
（一）卵磷脂的提取和纯化
磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿，部分溶于乙醇，极难溶于丙酮； 卵磷脂溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂，但不溶于丙酮； 丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。
因此，本实验用乙醇、乙醚为溶剂，丙酮为沉淀剂，干燥后
获得卵磷脂。新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接 触后因所含不饱和脂酸被氧化而呈黄褐色。卵磷脂中的胆碱，
1 4℃
2 25℃ 3 60℃ 1 4℃ 2 25℃ 3 60℃
2 20
3 30 1 10 3 30 1 10 2 20
3 1∶6
1 1∶4 2 1∶5 2 1∶5 3 1∶6 1 1∶4
I （I水平试验结果总合） II （II水平试验结果总合） III（III水平试验结果总合） I/3 II/3 III/3 级差
试验号
影响因素 [乙醇]∶ [乙醚] 温度 1 4℃ 2 25℃ 3 60℃ 时间（min） 1 10 2 20 3 30 料液比 1 1∶4 2 1∶5 3 1∶6
试验结果
表 4 试 验 安 排
1 2 3
1 5∶1 1 5∶1 1 5∶1
4
5 6 7 8 9
2 4∶1
2 4∶1 2 4∶1 3 3∶1 3 3∶1 3 3∶1
表1
抽提物、温度、时间和料液比4因素3水平
水平
1 2
影响因素 [乙醇]∶ [乙醚] 5∶1 4∶1 温度 4℃ 25℃ 时间（min） 10 20 料液比 1∶4 1∶5
3
3∶1
60℃
30
1∶6
表3
L9
表
按一般方法，如对4个因素3个水平的各种搭配都要考虑，共 需做3*3*3*3=81次试验，而用正交表只需做9次试验，即选用L9 表(L是正交表的代号，下标数字表示试验次数)。
在碱性溶液中可分解为三甲胺，而具有特异的鱼腥味，可用
于鉴定。
正交法实验设计
物质提取、纯化受到多种因素的影响，如抽提物 的种类及其配比、抽提条件（温度、时间等）都能影 响提取的结果。这种多因素的试验可以通过正交法， 即用一特制的表格—正交表来安排试验，计算和分析 试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。 本实验运用正交法抽提物的种类及其配比、时间 温度和料液比这4个因素对卵磷脂提取和纯化的影响， 并求得在什么样的条件下可以达到最佳的试验效果。
剂中，在密闭的层析缸中展层。
由于各种物质的结构和性质的不同，其在吸附 剂表面的吸附能力各异。吸附力大的易被吸附剂吸
附，而较难被展层剂所解吸。吸附力小的则不易被
吸附剂吸附，而易被展层剂携带至较远的距离。这
样，各种物质在吸附剂和展层剂之间反复多次的被
吸附与解吸附，就表现出不同的迁移率而得以分离， 并可以通过与显色剂的显色反应而得到鉴定与区分。
2．卵磷脂的纯化
取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl2水溶 液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃） 洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无 色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。
（二）卵磷脂的薄层层析
三、实验材料、仪器和试剂
（一）卵磷脂的提取和纯化
1、实验材料：鸡蛋黄
2、仪器：恒温水浴锅 蒸发皿 漏斗 磁力搅拌器 天平
3、试剂： 95百度文库乙醇
乙醚
丙酮
（二）卵磷脂的薄层层析
1、实验材料：提取的卵磷脂
2、仪 器： 电热鼓风干燥箱、 层析玻璃板、 层析 缸、吹风机、小型喷雾器 。
3、试 剂： （1）硅胶-G； （2）0. 2%羧甲基纤维素钠溶液；
将本试 验的4个 因素依 次放在 L9表的 第1，2， 3，4列， 再将各 列的水 平数用 该列因 素相应 的水平 写出来， 就得到 上表的 试验安 排。
（二）薄层层析
薄层层析（TLC）是一种微量而快速的层析方法。 其层析是在吸附剂（固相支持物）均匀涂布的的薄 层上进行的，故称薄层层析。而待分析的样品，是 点加到薄层板的一端，然后将该端浸入适宜的展层
一、实验目的
1、学习和掌握卵磷脂的提取和鉴定方法； 2、掌握薄层层析的原理、方法和应用。
是细胞膜磷脂双分子层的重要成分。
卵磷脂又称磷脂酰胆碱，是甘油磷脂的一种。在动植物
体内均有分布，在动物的脑、精液、心、肝、肾上腺和 卵细胞中含量较多，蛋黄中含量可达8-10％。
1、调浆：称取硅胶-G 4.5g →烧杯→ 12ml 0. 2%羧 甲基纤维素钠溶液→用玻璃棒调匀搅拌为浆状液。 2、涂布：取洁净、干燥玻璃板一块→下衬一张白纸→ 在桌面上放平→用烧杯将浆状物均匀倒在玻璃板上， 从一端开始，保持均匀一致，涂布面积1 ～4/5 。 3、干燥：在室温下凉干2分钟→60℃干燥箱烘30分钟。 4、活化：将干燥箱升温至120 ℃ ，活化30分钟后，关 闭电源，当玻璃板面温度降至不烫手时取出。
E
D C B A O O1 O2
六、思考题：
1、简述卵磷脂的生物学功能。
2、磷脂酰胆碱（卵磷脂），磷脂酰乙醇
胺（脑磷脂），磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇 的结构式。 3、何谓薄层层析？其原理和方法？ 4、制备硅胶-G薄层板与点样时应注意些什么问题？ 5、本实验中，哪一种组分的Rf值大一些？ 为什么？
7、显色：用喷雾器向薄层板上均匀喷洒1%碘液溶
液，热风吹干至色斑显现。
五、实验结果
1、卵磷脂收率 卵磷脂收率 = 卵磷脂粗品重量 / 蛋黄重量×100% 2、计算各组分的Rf 值 3、判断卵磷脂粗提物的组分 四种磷脂标准品的Ｒf值分别为:溶血卵磷脂0.18；神 经鞘磷脂0.33；卵磷脂0.65；磷脂酰乙醇胺0.96
5、点样：样点距玻璃板一端下缘1cm ，相互间隔
1～1.2 cm ；每位点重复点五次，每次用冷风吹干 后再点，每次点样直径不超过2mm 。 6、展层：在层析缸中加入展层剂0.5cm深，加盖平 衡30分钟，将点样端浸入，密闭展层10-30min。后
取出薄层板，标出展层剂前沿位置，用电吹风热风
将薄层板吹干。
（3）展层剂 ：氯仿∶甲醇∶水(65∶25∶4) ；
（4）显色剂：1% 碘液。
四、实验步骤
（一）卵磷脂的提取
1、卵磷脂的粗提 蛋黄10g放入洁净的带塞三角瓶中，加入95%乙醇 40ml，搅拌15min后，静置15min；然后加入10ml的乙 醚，搅拌15 min后，静置15min；过滤；滤渣进行二次提 取，加入乙醇与乙醚(体积比为3：1)的混合液30ml，搅拌、 静置一定时间；第二次过滤，合并二次滤液，加热浓缩至少 量，加入一定量丙酮除杂，卵磷脂即沉淀出来，即得到卵磷 脂粗品。
其结构式为：
胆
碱
HO
二、实验原理
（一）卵磷脂的提取和纯化
磷脂易溶于乙醚、苯、氯仿，部分溶于乙醇，极难溶于丙酮； 卵磷脂溶于乙醇、甲醇、氯仿等有机溶剂，但不溶于丙酮； 丙酮能够溶解油脂和游离脂肪酸、甘油三酯等。
因此，本实验用乙醇、乙醚为溶剂，丙酮为沉淀剂，干燥后
获得卵磷脂。新提取得到的卵磷脂为白色蜡状物，与空气接 触后因所含不饱和脂酸被氧化而呈黄褐色。卵磷脂中的胆碱，
1 4℃
2 25℃ 3 60℃ 1 4℃ 2 25℃ 3 60℃
2 20
3 30 1 10 3 30 1 10 2 20
3 1∶6
1 1∶4 2 1∶5 2 1∶5 3 1∶6 1 1∶4
I （I水平试验结果总合） II （II水平试验结果总合） III（III水平试验结果总合） I/3 II/3 III/3 级差
试验号
影响因素 [乙醇]∶ [乙醚] 温度 1 4℃ 2 25℃ 3 60℃ 时间（min） 1 10 2 20 3 30 料液比 1 1∶4 2 1∶5 3 1∶6
试验结果
表 4 试 验 安 排
1 2 3
1 5∶1 1 5∶1 1 5∶1
4
5 6 7 8 9
2 4∶1
2 4∶1 2 4∶1 3 3∶1 3 3∶1 3 3∶1
表1
抽提物、温度、时间和料液比4因素3水平
水平
1 2
影响因素 [乙醇]∶ [乙醚] 5∶1 4∶1 温度 4℃ 25℃ 时间（min） 10 20 料液比 1∶4 1∶5
3
3∶1
60℃
30
1∶6
表3
L9
表
按一般方法，如对4个因素3个水平的各种搭配都要考虑，共 需做3*3*3*3=81次试验，而用正交表只需做9次试验，即选用L9 表(L是正交表的代号，下标数字表示试验次数)。
在碱性溶液中可分解为三甲胺，而具有特异的鱼腥味，可用
于鉴定。
正交法实验设计
物质提取、纯化受到多种因素的影响，如抽提物 的种类及其配比、抽提条件（温度、时间等）都能影 响提取的结果。这种多因素的试验可以通过正交法， 即用一特制的表格—正交表来安排试验，计算和分析 试验结果。这样就能通过少量试验取得较好的效果。 本实验运用正交法抽提物的种类及其配比、时间 温度和料液比这4个因素对卵磷脂提取和纯化的影响， 并求得在什么样的条件下可以达到最佳的试验效果。
剂中，在密闭的层析缸中展层。
由于各种物质的结构和性质的不同，其在吸附 剂表面的吸附能力各异。吸附力大的易被吸附剂吸
附，而较难被展层剂所解吸。吸附力小的则不易被
吸附剂吸附，而易被展层剂携带至较远的距离。这
样，各种物质在吸附剂和展层剂之间反复多次的被
吸附与解吸附，就表现出不同的迁移率而得以分离， 并可以通过与显色剂的显色反应而得到鉴定与区分。
2．卵磷脂的纯化
取一定量的卵磷脂粗品，用无水乙醇溶解，得到约10% 的乙醇粗提液，加入相当于卵磷脂质量的10% 的ZnCl2水溶 液，室温搅拌0.5h；分离沉淀物，加入适量冰丙酮（4℃） 洗涤，搅拌1h，再用丙酮反复研洗，直到丙酮洗液为近无 色止，得到白色腊状的精卵磷脂；干燥；称重。
（二）卵磷脂的薄层层析
三、实验材料、仪器和试剂
（一）卵磷脂的提取和纯化
1、实验材料：鸡蛋黄
2、仪器：恒温水浴锅 蒸发皿 漏斗 磁力搅拌器 天平
3、试剂： 95百度文库乙醇
乙醚
丙酮
（二）卵磷脂的薄层层析
1、实验材料：提取的卵磷脂
2、仪 器： 电热鼓风干燥箱、 层析玻璃板、 层析 缸、吹风机、小型喷雾器 。
3、试 剂： （1）硅胶-G； （2）0. 2%羧甲基纤维素钠溶液；
将本试 验的4个 因素依 次放在 L9表的 第1，2， 3，4列， 再将各 列的水 平数用 该列因 素相应 的水平 写出来， 就得到 上表的 试验安 排。
（二）薄层层析
薄层层析（TLC）是一种微量而快速的层析方法。 其层析是在吸附剂（固相支持物）均匀涂布的的薄 层上进行的，故称薄层层析。而待分析的样品，是 点加到薄层板的一端，然后将该端浸入适宜的展层