愈创木酚比色法测定过氧化氢酶活性

过氧化物酶活性的测定（愈创木酚比色法）

原理

过氧化物酶广泛分布于植物的各个组织器官中。在有过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，可用分光光度计测量生成物的含量。

仪器药品

721型分光光度计离心机

秒表天平

研钵磁力搅拌器

愈创木酚30%过氧化氢

20mmol/L KH2PO4

100mmol/L 磷酸缓冲液，pH6.0（见附表2）

反应混合液：100mmol/L磷酸缓冲液(pH6.0)50ml于烧杯中，加入愈创木酚28μl，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入30%过氧化氢19μl，混合均匀，保存于冰箱中。

操作步骤

1．称取植物材料1g，加20mmol/L KH2PO45ml，于研钵中研磨成匀浆，以4000r/min 离心15分钟，倾出上清液保存在冷处，残渣再用5mlKH2PO4溶液提取一次，合并两次上清液，贮于冷处备用。

2．取光径1cm比色杯2只，于1只中加入反应混合液3ml，KH2PO41ml，作为校零对照，另1只中加入反应混合液3ml，上述酶液1ml（如酶活性过高可稀释之），立即开启秒表记录时间，于分光光度计上测量吸光度值，每隔1分钟读数一次，读数于波长

470nm下进行。

3．以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以△A470/min·mg蛋白质（或鲜重g）表示

实验三十八过氧化物酶活性的测定（比色法）

过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶，它与呼吸作用、光合作用及生长素的

氧化等都有密切关系，在植物生长发育过程中，它的活性不断发生变化，因此测量这种酶，可

以反映某一时期植物体内代谢的变化。

在有过氧化氢存在的条件下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶褐色物质，该物质在 470 nm 处有最大吸收，可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。

一、仪器、药品与材料

（一）实验材料

新鲜植物组织。

（二）仪器与用品

分光光度计，研钵，恒温水浴锅，100 mL 容量瓶，吸管，高速冷冻离心机，秒表，磁力搅拌

器。

（三）试剂

１．愈创木酚。

２．30％过氧化氢。

３．100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0 （见附录7）。

４．反应混合液：取100 mmol/L 磷酸缓冲液（pH 6.0）50 mL 于烧杯中，加入愈创木酚28 μL，于磁力搅拌器上加热搅拌，直至愈创木酚溶解，待溶液冷却后，加入 30 % 过氧化氢 19 μL，混合均匀，保存于冰箱中备用。

二、实验步骤

1．称取植物材料 0.1 g ，剪碎，放入研钵中，加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆，残渣再用

5 mL 磷酸缓冲液提取一次，以 4000 rpm 低温离心 15 min ，上清液即为粗酶液，定容至10

mL刻度，贮于低温下备用。

2．取2支试管，于1只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液1mL，作为对照，另1支中加入

反应混合液3 mL和上述酶液1mL（如酶活性过高可稀释之）。迅速将两支试管中溶液混匀后，

倒入比色杯，置于分光光度计样品室内，立即开启秒表记录时间，于470 nm 处测定吸光度

（OD）值，每隔10S读数一次。

3．结果计算：以每分钟OD变化值（ΔA470 / gFW min）表示酶活性大小，。也可以用每min

OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位（U）表示。

过氧化物酶活性（U/gFW·min）= ΔA470×VT/W×VS×0.01×t

式中：

ΔA470——反应时间内OD变化值。

VT ——提取酶液总体积（mL）。

W ——植物鲜重（g）。

Vs ——测定时取用酶液体积（mL）。

t ——反应时间（min）。

三、思考题

１．测定过氧化物酶活性除了本方法外，还可以采用什么方法进行？

２．在植物体内，过氧化物酶的底物会是哪些物质？在体外条件下，除掉可用愈创木酚外，你还可以使用什么底物？

３．植物组织中的多酚氧化酶是否会对本实验产生什么影响？为什么？